Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım
Summary
Burada yarı kalın beyin dilimleri görüntü floresan işaretli hücrelerin hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Sabitleme, dilimleme, beyin dokusu ve optik temizleme standart epifluorescent veya konfokal görüntüleme, sağlam sinir dokusu içinde bireysel hücreleri ve nöral ağların görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Abstract
, Hem temel ve klinik nörobilim temel bir hedefi, kimlikler, moleküler makyaj, ve hem de normal ve hastalıklı beyin nöronları için karakteristik bağlantı desen daha iyi anlamak için. Bu doğru, büyük bir çaba, yüksek çözünürlüklü nöroanatomik haritalar 1-3 bina yerleştirilmiştir . Moleküler genetik ve ışık mikroskobu gelişmeler genişleme nöronal morfolojileri sadece sorgulama yeteneği gelir, aynı zamanda bireysel nöronlar ve bunların ilişkili ağları 4 moleküler ve hücresel makyaj gelmiştir. Kemirgen transgenik ve gen hedefleme teknolojileri yoluyla nöron işareti ve manipüle etme yeteneği büyük gelişmeler olacak 5-6 'program' nöronal komutlara araştırmacılar izin verir. Muhtemelen, en etkili çağdaş nörobilim katkılarından biri hayati gazetecilere giderek genişleyen bir araç kutusu 9 verim 7-8, sonraki mühendislik yanında deniz omurgasızları floresan proteinleri (FP) kodlayan genlerin keşfi ve klonlama olmuştur . Ayrık nöron popülasyonları hedef FP ifade sürücü istismar hücre tipine spesifik promotor aktivitesi genetik hassasiyetle nöroanatomik soruşturma tanıyor.
Nöronlarda Mühendisliği FP ifade beyin yapısı ve işlevi anlayışımızı büyük ölçüde geliştirdi. Ancak, derin beyin dokularında, ya da üç boyutlu görüntüleme bireysel nöronlar ve bunların ilişkili ağlar, bir meydan okuma olarak kalmıştır. Yüksek lipid içeriği nedeniyle, sinir dokusu oldukça donuk ve sergiler otomatik floresan. Bu içsel biyofiziksel özellikleri zor onlarca mikron derinliklerde ötesinde standart epifluorescent veya konfokal mikroskopi kullanılarak yüksek çözünürlükte floresan etiketli nöronlar görselleştirmek ve görüntü olun. Bu meydan okuma araştırmacılar aşmak için sık sık seri ince kesitli görüntüleme ve rekonstrüksiyon yöntemleri 10, veya 2-foton lazer tarama mikroskopisi 11 kullanmaktayız. Bu yaklaşımların Şu sakıncaları sırasıyla ilişkili emek-yoğun doku hazırlanması, veya maliyet-engelleyici enstrümantasyon.
Burada, floresan etiketli hücreleri optik takas ve görüntüleme ile sabit yarı kalın fare beyin kesitleri görselleştirmek için oldukça hızlı ve basit bir yöntem mevcut. Ekli protokol yöntemlerini açıklar: 1) intrakardiyak perfüzyon, 2) diseksiyon ve tüm beyin kaldırılması, 3) agaroz, 4 sabit beyin gömme), yeni bir vibratome alet kullanarak hassas yarı kalın dilim hazırlama ile yerinde tespit beyin dokusu gliserol degrade üzerinden, 5) takas beyin dokusu, ve 6), ışık mikroskobu ve z-yığın yeniden yapılanma (Şekil 1) cam slaytlar montaj .
Beyin kesitleri hazırlamak için, nispeten yeni bir enstrümantasyon parça olarak adlandırılan 'Compresstome VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html) uygulanmaktadır. Bu cihaz, diğer vibratomes fonksiyonu benzer özelliklere sahip bir motorlu avans ve bıçak titreşim sistemi ile donatılmış bir yarı-otomatik mikrotom. Diğer vibratomes aksine, dilimlenmiş doku, paslanmaz çelik silindir içinde bir agaroz fiş monte edilir. İstediğiniz silindir arasında kalınlıklarda doku ekstrüde ve ileriye doğru ilerleyen titreşimli bıçak ile kesilir. Agaroz fiş / silindir sistemi tekrarlanabilir doku, montaj, hizalama ve hassas kesim sağlar. Bizim ellerde, 'Compresstome' verim için yüksek kaliteli doku elektrofizyoloji, immünhistokimya dilimleri, ve doğrudan sabit doku montaj ve görüntüleme. Optik temizleme birlikte, burada, yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme için yarı kalın sabit beyin dilim hazırlık göstermektedir.
Protocol
Discussion
, Işık mikroskobu, ekran, resim ve bozulmamış beyin dokusu içinde yapay sinir ağları analiz hızla vazgeçilmez bir araç olmuştur ihtiyacı üzerinden soruşturma nöronal alt kümelerini hedef floresan proteinleri kullanarak yaygın bir uygulama göz önüne alındığında.
, Kullanıcı dostu, in vivo elektroporasyon teknikleri viral vektörlerin, genetiği değiştirilmiş fare suşlarının gelişimi teknik gelişmeler artık araştırmak için etiketli hücre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma McNair Vakfı, NARSAD ve R00NS064171-03 NINDS hibe yoluyla destek tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the item | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Labs | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Chemicals Inc. | GX0185-6 | -or equivalent |
References
- Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. . The Connectome Project. , (2009).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, . Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
