Summary

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

Published: July 26, 2011
doi:

Summary

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.

Abstract

Un obiettivo fondamentale sia di base e clinica delle neuroscienze è quello di comprendere meglio le identità, trucco molecolare, e modelli di connettività che sono caratteristici di neuroni nel cervello sia normale e malato. In questo senso, un grande sforzo è stato posto sulla costruzione di mappe ad alta risoluzione neuroanatomici 1-3. Con l'espansione della genetica molecolare e progressi nella microscopia luce è venuta la possibilità di interrogare non solo morfologie neuronale, ma anche la composizione molecolare e cellulare dei singoli neuroni e delle loro reti associate 4. Importanti progressi nella capacità di segnare e manipolare i neuroni attraverso le tecnologie transgeniche e gene targeting nei roditori ora consentire agli investigatori di sottoinsiemi neuronale 'programma' a volontà 5-6. Probabilmente, uno dei contributi più influenti di neuroscienza contemporanea è stata la scoperta e la clonazione di geni che codificano per proteine ​​fluorescenti (PQ) in invertebrati marini 7-8, accanto ai loro ingegneria successive per produrre una sempre maggiore cassetta degli attrezzi di giornalisti vitale 9. Sfruttando cellula tipo-specifici promotore di attività mirate a guidare l'espressione FP in discrete popolazioni neuronali offre ora indagine neuroanatomici con precisione genetica.

Ingegneria espressione FP nei neuroni ha migliorato notevolmente la nostra comprensione della struttura del cervello e funzione. Tuttavia, i singoli neuroni imaging e le loro reti associate nei tessuti cerebrali profondi, o in tre dimensioni, è rimasta una sfida. A causa di alto contenuto di lipidi, tessuto nervoso è piuttosto opaco e auto presenta fluorescenza. Queste proprietà intrinseche biofisiche rendono difficile la visualizzazione e l'immagine neuroni fluorescente ad alta risoluzione con un microscopio confocale epifluorescente o al di là profondità di decine di micron. Per aggirare questo problema i ricercatori spesso utilizzano seriale sottile sezione imaging e metodi di ricostruzione 10, o 2-fotone microscopia a scansione laser 11. Svantaggi attuali a questi approcci sono associati alta intensità di lavoro di preparazione dei tessuti, o troppo costose strumentazioni rispettivamente.

Qui, vi presentiamo un metodo relativamente rapido e semplice per visualizzare le cellule fluorescente a fette topo fisso semi-densi cervello deselezionando ottici e di imaging. Nel protocollo allegato si descrivono i metodi di: 1) tessuto cerebrale di fissaggio in situ tramite perfusione intracardial, 2) la dissezione e la rimozione di intero cervello, 3) incorporando cervello stazionario in agarosio, 4) di precisione semi-densi preparazione fetta utilizzando nuovi strumenti vibratome compensazione, 5) il tessuto cerebrale da un gradiente di glicerolo, e 6) il montaggio su vetrini per microscopia ottica e z-stack ricostruzione (Figura 1).

Per la preparazione di fettine di cervello abbiamo implementato un pezzo relativamente nuovo di strumenti chiamato 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Questo strumento è un semi-automatico microtomo dotato di un anticipo motorizzato e vibrazioni sistema blade con caratteristiche simili in funzione di vibratomes altri. A differenza di altri vibratomes, il tessuto da tagliare è montato in una spina agarosio all'interno di un cilindro di acciaio inox. Il tessuto viene estruso a spessori desiderati dal cilindro, e tagliare con la lama in avanti avanzando vibrante. La spina agarosio / sistema cilindro permette di tessuto riproducibile montaggio, allineamento e il taglio di precisione. Nelle nostre mani, il 'Compresstome' alte rese fette qualità dei tessuti per elettrofisiologia, immunoistochimica, e diretto fissa tessuto di montaggio e di imaging. In combinazione con compensazione ottica, qui abbiamo dimostrato la preparazione di semi-densi fettine di cervello fissata per imaging ad alta risoluzione fluorescenti.

Protocol

1. Nella fissazione del cervello in situ * Preparare una siringa da 10 ml (28 gauge) riempite con tampone fosfato (PBS). * Preparare una siringa da 10 ml (28 gauge), riempito con il 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. Riservare un ulteriore 5-10 ml di PFA / PBS per il fissaggio post. Iniettare intraperitoneale sperimentale del mouse con una dose letale di Avertin o Nembutal. Una volta che il mouse è sedato, bagnato l'addome con l'etanolo e …

Discussion

Dato l'applicazione diffusa di utilizzare proteine ​​fluorescenti a bersaglio sottoinsiemi neuronale per le indagini tramite microscopia ottica, la necessità di rapido dello schermo, l'immagine, e analizzare le reti neurali all'interno del tessuto cerebrale intatto è diventata insostituibile.

I progressi tecnici nello sviluppo di vettori virali user-friendly, nelle tecniche di elettroporazione in vivo, e ceppi di topi geneticamente modificati, off…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato con il sostegno attraverso la Fondazione McNair, NARSAD e NINDS concedere R00NS064171-03.

Materials

Name of the item Company Catalogue number Comments (optional)
bone scissors F.S.T. 16044-10 -or equivalent
dissection scissors F.S.T. 14084-08 -or equivalent
type I-B agarose Sigma A0576  
Compresstome Precisionary Instruments VF-200 -other vibratomes are compatible
double sided adhesive Grace Bio-Labs SA-S-1L  
Superfrost Plus slides VWR 48311-703  
Cover glass VWR 48383-139  
glycerol EMD Chemicals Inc. GX0185-6 -or equivalent

References

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  2. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  3. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  4. Arenkiel, B. R., Ehlers, . Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
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  10. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).

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Cite This Article
Selever, J., Kong, J., Arenkiel, B. R. A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices. J. Vis. Exp. (53), e2807, doi:10.3791/2807 (2011).

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