Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Summary

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om de afbeelding fluorescent gelabelde cellen in semi-dikke hersenen plakken. Door de vaststelling van, snijden, en optisch clearing hersenweefsel beschrijven we hoe standaard epifluorescerende of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om individuele cellen en neuronale netwerken binnen intact zenuwweefsel te visualiseren.

Abstract

Een fundamentele doel om zowel fundamenteel en klinisch neurowetenschap is een beter begrip van de identiteit, moleculaire make-up, en patronen van connectiviteit die kenmerkend zijn voor neuronen in zowel de normale en zieke hersenen. Naar deze, heeft een grote inspanning is geplaatst op het bouwen van hoge-resolutie neuroanatomische maps ^1-3. Met de uitbreiding van de moleculaire genetica en de vooruitgang in het licht microscopie is gekomen de mogelijkheid om niet alleen de neuronale morfologie query, maar ook de moleculaire en cellulaire samenstelling van individuele neuronen en hun bijbehorende netwerken ^4. Belangrijke vooruitgang in het vermogen om te markeren en neuronen te manipuleren door middel van transgene en gentargeting technologieën in de knaagdieren nu toe dat de onderzoekers tot neuronale 'programma' subsets naar believen ^5-6. Ongetwijfeld, is een van de meest invloedrijke bijdragen aan de hedendaagse neurowetenschappen is de ontdekking en het klonen van genen die coderen voor fluorescerende eiwitten (KP's) in ongewervelde zeedieren ^7-8, naast hun latere engineering een steeds groeiende toolbox van vitaal verslaggevers ⁹ opleveren. Het benutten van celtype-specifieke promotor activiteit gerichte FP uitdrukking rijden in discrete neuronale populaties biedt nu neuroanatomische onderzoek met genetische precisie.

Techniek FP expressie in neuronen is enorm verbeterd ons begrip van de hersenen structuur en functie. Echter, imaging individuele neuronen en de bijbehorende netwerken in diepe hersenstimulatie weefsels, of in drie dimensies, bleef een uitdaging. Vanwege de hoge vetgehalte, zenuwweefsel is nogal ondoorzichtig en vertoont auto fluorescentie. Deze inherente biofysische eigenschappen maken het moeilijk om te visualiseren en het imago fluorescent gelabelde neuronen met een hoge resolutie met behulp van standaard epifluorescerende of confocale microscopie verder dan een diepte van tientallen micron. Te ontwijken deze uitdaging aan onderzoekers vaak gebruik serial thin-sectie imaging methoden en wederopbouw ^10, of twee-foton laser scanning microscopie ^11. De huidige nadelen aan deze benaderingen zijn de bijbehorende arbeidsintensieve weefsel preparaat, of kosten prohibitief instrumentatie respectievelijk.

Hier presenteren wij een relatief snelle en eenvoudige methode om fluorescent gelabelde cellen te visualiseren in vaste semi-dikke sneden de hersenen van muizen met optische clearing-en beeldvorming. In de bijgevoegde protocol beschrijven we de methoden van: 1) de vaststelling van hersenweefsel in situ via intracardiale perfusie, 2) dissectie en verwijdering van hele hersenen, 3) stationaire hersenen inbedding in agarose, 4) precisie semi-dikke plak voorbereiding met behulp van nieuwe instrumenten vibratome , 5) clearing hersenweefsel door middel van een glycerol gradiënt, en 6) montage op glazen dia's voor lichtmicroscopie en de z-stack reconstructie (figuur 1).

Ter voorbereiding van de hersenen plakjes we een relatief nieuw stuk van de instrumentatie de 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Dit instrument is een semi-automatische microtoom uitgerust met een gemotoriseerde vooraf en blade-vibratie systeem met soortgelijke kenmerken in functie van andere vibratomes. In tegenstelling tot andere vibratomes, is het weefsel te worden gesneden gemonteerd in een agarose plug in een roestvrij stalen cilinder. Het weefsel wordt geëxtrudeerd bij de gewenste dikte van de cilinder, en snijd de forward oprukkende vibrerende mes. De agarose plug / cilinder-systeem zorgt voor reproduceerbare weefsel montage, uitlijning en precisie snijden. In onze handen, de 'Compresstome' levert een hoge kwaliteit tissue slices voor de elektrofysiologie, immunohistochemie, en directe vaste weefsel montage en beeldvorming. In combinatie met optische clearing, hier tonen we de voorbereiding van de semi-dikke vaste hersencoupes voor hoge-resolutie fluorescerende beeldvorming.

Protocol

1. In situ hersenen fixatie * Bereid een 10 ml spuit (28 gauge naald) gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). * Bereid een 10 ml spuit (28 gauge naald) gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Reserveer een extra 5-10 ml van de PFA / PBS voor post fixatie. Injecteer experimentele muis intraperitoneaal met een dodelijke dosis van Avertin of Nembutal. Zodra de muis wordt verdoofd, nat van de buik met ethanol en veilig met de muis naar de onde…

Discussion

Gezien de wijdverbreide toepassing van het gebruik van fluorescerende eiwitten aan neuronale subsets doelstelling voor onderzoek via lichtmicroscopie, de noodzaak om snel het scherm, beeld, en analyseren van neurale netwerken binnen intact hersenweefsel is geworden van onschatbare waarde.

Technische vooruitgang in de ontwikkeling van gebruiksvriendelijke virale vectoren, in vivo elektroporatie technieken, en genetisch gemodificeerde muizenstammen biedt nu een schijnbaar onuitputteli…

Materials

Name of the item	Company	Catalogue number	Comments (optional)
bone scissors	F.S.T.	16044-10	-or equivalent
dissection scissors	F.S.T.	14084-08	-or equivalent
type I-B agarose	Sigma	A0576
Compresstome	Precisionary Instruments	VF-200	-other vibratomes are compatible
double sided adhesive	Grace Bio-Labs	SA-S-1L
Superfrost Plus slides	VWR	48311-703
Cover glass	VWR	48383-139
glycerol	EMD Chemicals Inc.	GX0185-6	-or equivalent