セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ
Summary
ここでは、半厚い脳スライスの画像蛍光標識細胞に迅速かつ簡単な方法を説明します。 、固定スライス、および光学的に脳組織をクリアすることによって我々は標準的な落射蛍光または共焦点イメージングが無傷の神経組織内の個々の細胞や神経回路網を可視化するために使用できる方法について説明します。
Abstract
基礎および臨床の両方神経科学の基本的な目標は、より正常と病気の両方脳内の神経細胞に特徴的なアイデンティティ、分子構造、および接続性のパターンを理解することです。この向かって、多大な労力は1-3高解像度の神経解剖学的マップを構築する上に配置されています。光学顕微鏡で分子遺伝学と進化の拡大と神経形態だけでなく、クエリを実行する能力だけでなく、個々の神経細胞とそれらに関連付けられたネットワーク4の分子や細胞のメイクアップを歩んできました。げっ歯類のトランスジェニックおよび遺伝子ターゲティング技術を介して神経細胞をマークし、操作する能力の大きな進歩は、今回5月6日で"プログラム"神経サブセットに調査官を許可する。間違いなく、現代の神経科学に最も影響力の貢献の一つは、重要な記者の拡大を続けるツールボックス9を得るために彼らのその後のエンジニアリングと並んで、7-8海洋無脊椎動物の蛍光蛋白質（fps）をコードする遺伝子の探索とクローニングをしている。離散的な神経集団の標的とFPの発現を駆動するために悪用する細胞タイプ特異的プロモーター活性は遺伝的精度で神経解剖学的調査を与える。
ニューロンの工学FPの発現は非常に脳の構造と機能の理解を向上しています。しかし、脳深部の組織で、または三次元の画像の個々の神経細胞とそれらに関連付けられたネットワークは、挑戦を続けている。高脂質含有量に起因する、神経組織はかなり不透明であると自家蛍光を示す。これらの固有の生物物理学的特性は、それが困難な数十ミクロンの深さを超えて標準的な落射蛍光または共焦点顕微鏡を用いて高分解能での蛍光標識された神経細胞を可視化し、イメージすること。この課題の研究者を回避するには、多くの場合、シリアル薄い断面の撮影と再構成法10、または2光子レーザー走査顕微鏡11を採用。これらのアプローチの現在の欠点は、それぞれ関連付けられている労働集約型組織の準備、もしくはコスト高の計測です。
ここで、我々は、光クリアとイメージングによる固定半厚いマウスの脳スライスで蛍光標識された細胞を可視化するため、比較的迅速かつ簡単な方法を提示する。添付のプロトコールではの方法について説明します。心臓内の血流、2）解剖と脳全体の除去、3）アガロース、4の固定脳の埋め込 み）新しいビブラトームインストルメンテーションを使用して精密半厚いスライス標本を経由してその場で 1）固定脳組織、5）グリセロール勾配を通じて脳組織をクリア、および6）光学顕微鏡とZ -スタック再建（ 図1）用のガラススライドにマウント。
脳スライスを準備するために我々は、計測の比較的新しい作品が"Compresstome"VF – 200（http://www.precisionary.com/products_vf200.html）と呼ばれる実装しました。この楽器は、他のvibratomesに機能的に似たような機能を持つ電動事前に、ブレードの振動系を搭載した半自動ミクロトームです。他のvibratomesとは異なり、スライスする組織は、ステンレス製シリンダー内にアガロースプラグにマウントされています。組織は、目的のシリンダーから厚さで押し出され、そして前方に進める振動刃でカット。アガロースプラグ/シリンダーシステムは再現性の組織が、取付位置合わせ、および精密切削加工が可能になります。私たちの手、"Compresstome"利回り電気生理学、免疫組織化学、および直接取付、固定組織やイメージングのための高品質の組織切片で。光学清算と組み合わせることで、ここで我々は高分解能蛍光イメージングのための半厚い固定脳スライスの準備を示しています。
Protocol
Discussion
光学顕微鏡、急速に画面の必要性、画像、経由して調査のための神経細胞のサブセットをターゲットにし、無傷の脳組織内にニューラルネットワークを分析する蛍光タンパク質を使用しての広範な応用を考えると非常に貴重となっています。
ユーザーフレンドリーなウイルスベクターの開発における技術的進歩は、 生体内エレクトロポレーション技術、及び遺伝?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、マクネア財団、NARSAD、およびNINDS助成R00NS064171 – 03をサポートすることによって資金を供給された。
Materials
| Name of the item | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Labs | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Chemicals Inc. | GX0185-6 | -or equivalent |
References
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