Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz
Summary
Telomeraz katalitik altbirim izole etmek için çabalar, TERT, yapısal çalışmalar için yeterli miktarda, bir on yıl daha sınırlı bir başarı ile yerine getirildiğini var. Burada, rekombinant Tribolium castaneum TERT izolasyonu (yöntemleri mevcut<em> Tc</em> TERT) ve aktif sulandırıldıktan<em> T. castaneum</em> Telomeraz ribonükleoprotein (RNP) karmaşık<em> In vitro</em>.
Abstract
Telomeraz katalitik altbirim izole etmek için çabalar, TERT, yapısal çalışmalar için yeterli miktarda, bir on yıl daha sınırlı bir başarı ile yerine getirildiğini var. Burada, rekombinant Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) izolasyonu ve aktif T. sulandırıldıktan yöntemleri mevcut in vitro castaneum telomeraz ribonükleoprotein (RNP) karmaşık.
Telomeraz, bir uçtan-uca füzyon ve bozulmaya karşı korumak için hizmet doğrusal kromozomların 2 3 'sonuna kadar, telomer denilen kısa DNA tekrarlar, ekleyen özel bir ters transkriptaz 1. DNA replikasyonu takiben, kısa segment 3 kromozom sonunda kaybolur ve telomeraz olmadan sonunda kendi Hayflick Sınırı 4 ulaşana kadar, hücre bölünmesi devam eder. Ayrıca, telomeraz yetişkinlerde en somatik hücre 5 içinde uyuyan, ancak kanser hücreleri, hücre ölümsüzlük 7 teşvik 6 aktif .
Enzimin katalitik alt birim ve şablon TERT telomer 8,9 sentezlemek için kullandığı içeren ayrılmaz bir RNA bileşeni (TER), oluşan protein altbirim (TERT), minimal telomeraz enzimi iki temel bileşenden oluşmaktadır. 2008'den önce, ayrı ayrı telomeraz etki alanları için sadece yapıları 10,11 çözüldü. T. katalitik altbirim aktif 12 kristal yapının belirlenmesi, bu alanda büyük bir atılım geldi castaneum telomeraz, Tc TERT 1.
Burada, yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için aktif, çözünür Tc TERT ve telomeraz aktivitesi testleri için in vitro telomeraz RNP kompleks sulandırıldıktan büyük miktarlarda üretmek için yöntemler sunuyoruz. Kullanılan deneysel yöntemler hakkında genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.
Protocol
Discussion
Burada sunulan yöntemi büyük miktarlarda T. katalitik subunit üretim için izin verir çözünür, yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için aktif olarak castaneum telomeraz TERT. Tc TERT üzerinden ifade yöntemi yukarıda belirtilen sıcaklık ya da hücre yoğunluğu ince değişikliklere duyarlı ve protein ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde etkileyebilir . Özellikle, biz optik yoğunluğu 600 nm'de 0.5 ulaşmadan önce protein ekspresyonu hücreleri indükleyen ya da sıc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pennsylvania Sağlık Bölümü, Ellison Tıp, V ve The Emerald Vakıflar tarafından desteklenen araştırma sundu.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H. Telomeres: no end in sight. Cell. 77, 621-623 (1994).
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
