Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi
Summary
Gli sforzi per isolare la subunità catalitica della telomerasi, TERT, in quantità sufficienti per studi strutturali, sono stati accolti con scarso successo da oltre un decennio. Qui, vi presentiamo i metodi per l'isolamento dei ricombinanti Tribolium castaneum TERT (<em> Tc</em> TERT) e la ricostituzione del principio attivo<em> T. castaneum</em> Ribonucleoproteina telomerasi (RNP) complesso<em> In vitro</em>.
Abstract
Gli sforzi per isolare la subunità catalitica della telomerasi, TERT, in quantità sufficienti per studi strutturali, sono stati accolti con scarso successo da oltre un decennio. Qui, vi presentiamo i metodi per l'isolamento dei ricombinanti Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) e la ricostituzione del T. attivo castaneum telomerasi ribonucleoproteina (RNP) complessi in vitro.
La telomerasi è una trascrittasi inversa specialisti 1 che aggiunge ripete DNA brevi, chiamate telomeri, porre fine al 3 'dei cromosomi lineari 2 che servono per proteggerli da end-to-end di fusione e di degrado. A seguito di replicazione del DNA, un breve segmento è perso alla fine del cromosoma 3 e senza telomerasi, le cellule continuare a dividere fino alla fine raggiungendo il limite Hayflick 4. Inoltre, la telomerasi è latente nella maggior parte delle cellule somatiche 5 in adulti, ma è attiva nelle cellule tumorali 6, dove si promuove l'immortalità delle cellule 7.
L'enzima telomerasi minimo è costituito da due componenti principali: la subunità proteiche (TER), che comprende la subunità catalitica dell'enzima e parte integrante di RNA (TER), che contiene il TERT modello utilizza per sintetizzare i telomeri 8,9. Fino al 2008, solo le strutture per i domini telomerasi individuo era stato risolto 10,11. Un importante passo avanti in questo campo è venuto dalla determinazione della struttura cristallina dei 12 attivi, subunità catalitica di T. castaneum telomerasi, Tc TERT 1.
Qui, vi presentiamo i metodi per la produzione di grandi quantità del principio attivo, TERT solubile Tc per studi strutturali e biochimici, e la ricostituzione del complesso RNP telomerasi in vitro per analisi attività della telomerasi. Una panoramica dei metodi sperimentali utilizzati è mostrata in Figura 1.
Protocol
Discussion
Il metodo presentato qui permette la produzione di grandi quantità della subunità catalitica di T. castaneum TERT telomerasi nelle solubile, forma attiva per studi strutturali e biochimici. Il metodo di Tc TERT sovra-espressione è sensibile ai cambiamenti sottili di temperatura o la densità delle cellule da quelle di cui sopra e possono influenzare notevolmente i livelli di espressione della proteina. In particolare, abbiamo trovato che inducono le cellule per l'espressione delle proteine ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca qui presentata è stata supportata dal Dipartimento della Salute della Pennsylvania, Il Medical Ellison, V e I fondamenti Smeraldo.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
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