В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза
Summary
Попытки изолировать каталитической субъединицы теломеразы, трет, в количествах, достаточных для структурных исследований, были встречены с ограниченным успехом уже более десяти лет. Здесь мы представляем методы для выделения рекомбинантного Tribolium castaneum TERT (<em> Тс</em> TERT) и восстановление активных<em> Т. castaneum</em> Теломеразы рибонуклеопротеидных (RNP) комплекс<em> В пробирке</em>.
Abstract
Попытки изолировать каталитической субъединицы теломеразы, трет, в количествах, достаточных для структурных исследований, были встречены с ограниченным успехом уже более десяти лет. Здесь мы представляем методы для выделения рекомбинантного Tribolium castaneum TERT (Тс TERT) и восстановление активного Т. castaneum теломеразы рибонуклеопротеидных (RNP) комплекс в пробирке.
Теломераза является специализированным обратной транскриптазы 1, который добавляет коротких повторов ДНК, называемые теломеры, до конца 3 'линейных хромосом 2, которые служат для защиты их от конца в конец синтеза и деградации. После репликации ДНК, короткий сегмент потерял в конце хромосомы 3 и без теломеразы, клетки продолжают деления пока в конце концов достигая своего Хейфлика Предельная 4. Кроме того, теломеразы является бездействующим в большинстве соматических клеток 5 у взрослых, но принимает активное участие в раковые клетки, 6, где он способствует ячейки бессмертии 7.
Минимальный фермент теломераза состоит из двух основных компонентов: белков субъединицы (трет), в состав которого входят каталитическая субъединица фермента и компонентов интегральной РНК (TER), который содержит шаблон TERT использует для синтеза теломер 8,9. До 2008 года только структуры для отдельных доменов теломеразы была решена 10,11. Прорыв в этой области пришли из определения кристаллической структуры активных 12, каталитические субъединицы Т. castaneum теломеразы, Тс TERT 1.
Здесь мы представляем методы получения большого количества активных, растворимые TERT Тс для структурных и биохимических исследований, а также восстановление комплекса теломеразы RNP в пробирке для анализов активности теломеразы. Обзор экспериментальных методов, используемых показано на рисунке 1.
Protocol
Discussion
Метод, представленный здесь позволяет производить большие объемы каталитической субъединицы Т. castaneum теломеразы TERT в растворимой, активной формы для структурных и биохимических исследований. Метод Тс TERT чрезмерное выражение чувствительны к тонким изменениям температуры ил…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, представленные здесь была поддержана Пенсильвании Департамент здравоохранения, Эллисон Медицинская, V и Изумрудный фондов.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H. Telomeres: no end in sight. Cell. 77, 621-623 (1994).
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
