המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט (<em> Tc</em> טרט) ואת הכינון מחדש של פעיל<em> ט castaneum</em> Telomerase ribonucleoprotein (RNP) מורכב<em> במבחנה</em>.
המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט (Tc טרט) ואת הכינון מחדש של ט פעיל ribonucleoprotein castaneum telomerase (RNP) מורכב במבחנה.
Telomerase הוא transcriptase הפוכה התמחה 1 המוסיפה חוזר דנ"א קצרים, נקרא הטלומרים, עד הסוף '3 של כרומוזומים ליניארית 2 המשמשים כדי להגן עליהם מפני היתוך end-to-end והשפלה. בעקבות שכפול הדנ"א, קטע קצר הוא איבד בסוף כרומוזום 3 וללא telomerase, התאים ממשיכים להתחלק עד שבסופו של דבר להגיע הגבלת Hayflick שלהם 4. בנוסף, telomerase הוא רדום ברוב התאים הסומטיים 5 אצל מבוגרים, אך היא פעילה 6 תאים סרטניים בהם הוא מקדם את אלמוות תא 7.
האנזים telomerase מינימלי מורכבת משני רכיבי הליבה: למקטע החלבון (טרט), אשר כוללת את למקטע הקטליטי של האנזים ואת מרכיב בלתי נפרד RNA (TER), אשר מכיל את תבנית משתמש טרט לסנתז הטלומרים 8,9. לפני 2008, רק מבנים בודדים לתחומים telomerase נפתרו 10,11. פריצת דרך משמעותית בתחום זה בא קביעת המבנה הגבישי של 12 הפעיל, למקטע הקטליטית של ט ' telomerase castaneum, Tc טרט 1.
כאן, אנו מציגים שיטות להפקת כמויות גדולות של טרט פעיל, Tc מסיסים ללימודי מבניים ביוכימיים, ואת הכינון מחדש של המתחם telomerase RNP במבחנה עבור מבחני פעילות הטלומרז. סקירה של שיטות ניסיוניות בשימוש מוצג באיור 1.
השיטה המוצגת כאן מאפשרת ייצור של כמויות גדולות של למקטע הקטליטית של ט ' castaneum טרט telomerase בצורת, מסיסים פעיל ללימודי מבניים ביוכימיים. השיטה של Tc טרט יתר ביטוי רגיש שינויים עדינים בטמפרטורה או צפיפות התאים מאלה כאמור לעיל יכול להשפיע באופן דרמטי את רמות ביטו…
The authors have nothing to disclose.
המחקר המוצג כאן נתמכה על ידי משרד הבריאות של פנסילבניה, רפואי אליסון, V ו יסודות אמרלד.
Name of Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
2YT Broth | Teknova | Y0215 |
IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
RNaseZap | Ambion | AM9780 |
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |