Floresans Görüntüleme Living İzole Omurgalı fotoreseptör hücrelerinin hazırlanması
Summary
Floresan görüntüleme için farklı omurgalı türlerin tek yaşam fotoreseptör hücrelerinin hazırlanması için bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, NADH ya da A vitamini gibi endojen fluorophores, floresan görüntü veya Ca duyarlı Eksojen olarak eklenmiş floresan boyalar olabilir<sup> 2 +</sup> Ya da diğer faktörler.
Abstract
Gözdeki, phototransduction ışık, bir elektrik sinyali dönüşüm, çubuk ve koni fotoreseptör hücrelerinin 1-4 tarafından yürütülmektedir. Rod fotoreseptörlerin loş ışıkta görme, parlak ışık konileri sorumludur. Phototransduction fotoreseptör hücre, görsel pigment, birincil ışık detektörü yüksek konsantrasyonda içeren özel bir bölmesi dış segmentinde yer alır. Retina cis, protein, opsin bağlı bir kromofor, 11 görme pigmenti oluşur. Görsel pigment tarafından emilir bir foton 11 kromofor isomerizes – cis-trans. Bu photoisomerization membran potansiyeli bir değişiklik sonuçlanan ve bir elektrik sinyali ışık uyaran transdüksiyon hakkında getirerek reaksiyonlar zincirini başlatan görsel pigment konformasyonel değişikliği beraberinde getiriyor. Işık uyarımı hücre kurtarma ışık ile aktive ara devre dışı bırakma ve membran potansiyeli yeniden kurulması içerir. Ca 2 + birkaç phototransduction yer alan enzimlerin aktivitesini modüle ve konsantrasyonu ışık uyarımı üzerine azalır. Bu şekilde, Ca 2 + hücre arka plan ışığı, ışık uyarılması ve adaptasyonu kurtarma önemli bir rol oynar .
All-trans 5-7 cis kromofor iyileşme sürecinin bir diğer önemli bölümü, 11 photoisomerization ışık algılama sırasında tahrip olmuştur görsel pigment rejenerasyon. Bu yenilenme, apo-protein opsin geride bırakarak, all-trans retina photoactivated pigmenti tarafından serbest bırakılması ile başlar . Serbest bırakılan all-trans retina all-trans retinol, ve opsin NADPH kullanan bir tepki olarak hızla azalır, taze 11 ile birleşir – cis retina, görme pigmenti reform dış segmente getirilen. All-trans retinol sonra uzman taşıyıcı Interphotoreceptor retinoid Bağlayıcı Protein (IRBP) dış segmente ve komşu hücre içine transfer edilir.
Floresan görüntüleme tek fotoreseptör hücrelerinin fizyolojisi ve hücre biyolojisi okumak için kullanılabilir. Ca 2 + duyarlı floresan boyalar 8-12 iç segmenti Ca 2 Ca 2 + mağazalar rolünün yanı sıra ışık dış segmente Ca 2 + değişiklikleri ve tepki arasındaki etkileşimi ayrıntılı olarak incelemek için kullanılabilir + homeostazı 13,14 . Floresan boyalar Mg 2 ölçmek için kullanılabilir + konsantrasyonu 15, pH, sulu ve membran bölmeleri 16 izleyiciler olarak. Son olarak, tüm-trans retinol (A vitamini) içsel floresan 17-19 tek fotoreseptör hücrelerinin oluşumu ve kaldırma kinetiği izlemek için kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Izole sağlıklı hücreler elde değilseniz, retinanın izolasyonu veya sağlık sorunu ya da doğrama ya yatıyor. Tipik olarak, göz ve vitreus ön çıkardıktan sonra, retina pigment epitel kolayca havalandığı. Göz yuvası çevreden başlayarak kapalı değilse, bunu kabuğu deneyin. Hala ayırmak için zor ise, daha büyük bir olasılık hayvan yeterli bir zaman dilimi için koyu adapte olmamıştır, ya da kırmızı ışık çok parlak. Hayvan için uygun karanlık adaptasyonu, ve loş kırmızı ışık ol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NEI hibe EY014850 tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y. Vertebrate Photoreceptors. Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in Vertebrate Photoreceptors. Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).
- Palczewski, K. G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin. Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
