一个方法是为单身的生活,从不同的脊椎动物物种的荧光成像的感光细胞的准备。该方法可用于图像的内源性荧光基团,如NADH或维生素A,的荧光,或外源性补充钙敏感的荧光染料,<sup> 2 +</sup>或其他因素。
在脊椎动物视网膜,phototransduction,光转换为电信号,进行了由杆和锥感光细胞1-4。棒感光器负责在昏暗的光线,在明亮的光线锥的视野。 Phototransduction的感光细胞外,一个专门的车厢,其中包含一个视觉色素,主光探测器的高浓度段的地方。视色素是一个生色,11 – 顺视网膜附着的蛋白质,视蛋白组成。视觉色素吸收光子异构从11生色团- 独联体国家全反式 。这种光致异构化带来了一个启动一个级联反应,最终在膜电位的变化,为电信号的传导光刺激的视觉色素的构象变化。光刺激的细胞恢复涉及的失活,由光激活的中间体和膜电位的重建。的Ca 2 +调节几个phototransduction涉及的酶的活性,减少光刺激后,其浓度。在这样的Ca 2 +在细胞光刺激,其背景光的适应复苏起着重要作用。
恢复过程的另一个重要组成部分,已在光检测摧毁其11的光致异构化的视觉色素的再生–独联体生色全反式5-7。这种再生开始的全反式视网膜的光敏色素的释放,留下的APO -蛋白视蛋白。被释放的全反式视网膜利用NADPH的全反式视黄醇,视蛋白反应迅速减少,结合新鲜的11 –顺视网膜带来改革的视觉色素外段。全反式视黄醇,然后转移到邻近的细胞外段和专门载体Interphotoreceptor维甲酸结合蛋白(IRBP)。
单一的感光细胞的荧光成像可用于他们的生理和细胞生物学研究。的Ca 2 +敏感的荧光染料,可用于详细研究外段的Ca 2 +的变化和反应之间的相互作用 ,以光 8-12以及内心的Ca 2段中的作用的Ca 2 +存储+动态平衡13,14 。荧光染料,也可用于测量镁2 +浓度,pH值,以及水和膜车厢 16示踪剂。最后,全反式视黄醇(维生素A)的内在荧光可以用来监测其形成的动力学和17日至19日在单一的感光细胞去除。
如果未取得健康孤立的细胞,但问题在于与隔离或视网膜的健康,或者其斩。通常情况下,取出后,眼睛的玻璃体前,视网膜随时升空色素上皮细胞。如果没有,尝试从外围眼罩开始剥离它关闭。如果它仍然是难以分开,一个可能性是,动物还没有足够的时间内,暗适应,或太亮了红灯。确保适当的暗适应的动物,和昏暗的红灯。在视网膜上的杆光感受器的存在,可以很容易地通过检查孤立的视?…
The authors have nothing to disclose.
支持内授予EY014850。
Name | Company | Catalogue number | Comments |
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Dark room (100-150 ft2) | |||
Red lights19 | Online stores | ||
Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |