Vorbereitung der Lebens-Isolated Vertebrate Sehzellen für Fluoreszenz-Imaging
Summary
Eine Methode ist für die Herstellung von einzelnen lebenden Sehzellen aus verschiedenen Wirbeltierarten für Fluoreszenz-Bildgebung beschrieben. Die Methode kann zur Abbildung der Fluoreszenz von endogenen Fluorophore wie NADH oder Vitamin A, oder dass von exogen zugesetztem Fluoreszenzfarbstoffen empfindlich gegen Ca<sup> 2 +</sup> Oder anderen Faktoren.
Abstract
In der Retina ist Phototransduktion, die Umwandlung von Licht in ein elektrisches Signal, durch die Stäbchen und Zapfen Sehzellen 1-4 durchgeführt. Stäbchen-Photorezeptoren sind für das Sehen zuständig bei schwachem Licht, Kegel in helles Licht. Phototransduktion erfolgt in den äußeren Teil der Sehzellen, ein spezialisiertes Fach, dass eine hohe Konzentration von visuellen Pigment, das primäre Lichtdetektor enthält. Cis-Retinal, die an ein Protein, Opsin – Die visuelle Pigment besteht aus einem Chromophor, 11 zusammengesetzt. Ein Photon durch die visuelle Pigment absorbiert isomerisiert des Chromophors von 11 – cis zu all-trans. Diese Photoisomerisierung führt zu einer Konformationsänderung in die visuelle Pigment, das eine Kaskade von Reaktionen gipfelte in einer Änderung des Membranpotentials, und die Herbeiführung einer Transduktion der Lichtreiz in ein elektrisches Signal auslöst. Die Erholung der Zelle aus Licht Stimulation beinhaltet die Deaktivierung der Zwischenprodukte durch Licht aktiviert, und die Wiederherstellung des Membranpotentials. Ca 2 + moduliert die Aktivität von mehreren der Enzyme in Phototransduktion beteiligt, und seine Konzentration auf Licht Stimulation reduziert. Auf diese Weise Ca 2 + spielt eine wichtige Rolle in der Erholung der Zelle aus Licht Stimulation und seine Anpassung an Hintergrundlicht.
Ein weiterer wesentlicher Bestandteil der Recovery-Prozess ist die Regeneration der visuellen Pigment, während Licht-Erkennung wurde durch die Photoisomerisierung von seinen 11 zerstört – cis Chromophor all-trans 5-7. Diese Regeneration beginnt mit der Veröffentlichung von all-trans Retinal durch die photoaktivierte Pigment, hinterlässt der Apo-Protein Opsin. Die freigesetzten all-trans-Retinal wird schnell in eine Reaktion unter Verwendung von NADPH zu all-trans-Retinol und Opsin reduziert kombiniert mit frischen 11 – cis-Retinal in die äußere Segment der Sehpigment Reform gebracht. All-trans-Retinol wird dann aus dem äußeren Bereich und in den benachbarten Zellen, die durch den spezialisierten Träger Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP) übertragen.
Fluoreszenz-Imaging von einzelnen Sehzellen kann verwendet werden, um ihre Physiologie und Zellbiologie studieren. Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen kann verwendet werden, um im Detail zu untersuchen das Zusammenspiel zwischen äußeren Segment Ca 2 + Veränderungen und Antwort zu 8-12 sowie die Rolle der inneren Segment Ca 2 + Läden in Ca 2 +-Homöostase Licht 13,14 . Fluoreszierende Farbstoffe können auch zur Messung von Mg 2 +-Konzentration verwendet werden 15, pH-Wert und als Tracer von wässrigen und Membran Fächer 16. Schließlich kann die Eigenfluoreszenz von all-trans-Retinol (Vitamin A) verwendet werden, um die Kinetik der Bildung und Entfernung in einzelnen Sehzellen 17-19 überwachen.
Protocol
Discussion
Wenn gesunde isolierten Zellen nicht erhalten werden, liegt das Problem entweder mit der Isolierung oder der Gesundheit der Netzhaut oder mit ihren Hacken. In der Regel nach dem Entfernen der Vorderseite des Auges und der Glaskörper, die Netzhaut leicht hebt das Pigmentepithel. Wenn es nicht zu schälen versuchen Sie ausgehend von der Peripherie der Augenmuschel. Wenn es immer noch schwer zu trennen, ist eine wahrscheinliche Möglichkeit, dass das Tier wurde nicht dunkel-adaptierten für eine angemessene Zeit, oder das…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt durch NEI gewähren EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
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