إعداد يعيشون معزولين خلايا مستقبلة للضوء الفقارية للتصوير الإسفار
Summary
تم وصف طريقة لإعداد واحدة من خلايا مستقبلة للضوء الذين يعيشون نوعا من الفقاريات المختلفة للتصوير مضان. ويمكن استخدام هذه الطريقة لصورة مضان من fluorophores الذاتية ، مثل NADH أو فيتامين (أ) ، أو أن من الأصباغ الفلورية خارجيا وأضاف حساسة لكاليفورنيا<sup> 2 +</sup> أو غيرها من العوامل.
Abstract
في شبكية الفقاريات ، ويتم phototransduction ، وتحويل الضوء إلى إشارات كهربائية وبها قضبان وخلايا مستقبلة للضوء مخروط 1-4. قضيب مبصرات هي المسؤولة عن الرؤية في الضوء الخافت ، والأقماع في الضوء الساطع. Phototransduction يحدث في الجزء الخارجي للخلية مستقبلة للضوء ، حجرة المتخصصة التي تحتوي على نسبة عالية من الأصباغ البصرية ، وكاشف الضوء الأساسي. تتكون صبغة بصرية من حامل اللون ، 11 — رابطة الدول المستقلة في شبكية العين ، تعلق على البروتين ، opsin. الفوتون تمتصه صبغة بصرية isomerizes حامل اللون في الفترة من 11 — رابطة الدول المستقلة إلى العابرة للجميع. الايزوميرة الضوئية يجلب هذا التغيير متعلق بتكوين في الصباغ البصرية الذي يبدأ سلسلة من ردود الفعل وبلغت ذروتها في تغيير محتمل في الغشاء ، وإحداث تنبيغ من التحفيز الضوء إلى إشارات كهربائية. استعادة الخلية من التحفيز تنطوي على ضوء التعطيل من وسيطة تفعيلها من خلال الضوء ، وإمكانات إعادة الغشاء. كاليفورنيا 2 + ينظم نشاط العديد من الأنزيمات المشاركة في phototransduction ، ويتم تقليل تركيزه على تحفيز الضوء. في هذه الطريقة ، كا 2 + يلعب دورا مهما في استعادة الخلية من التحفيز الخفيفة والتكيف للضوء الخلفية.
آخر جزء أساسي من عملية الانتعاش هو تجديد الصباغ البصرية التي تم تدميرها خلال الكشف عن الضوء من قبل الايزوميرة الضوئية من 11 في — حامل اللون رابطة الدول المستقلة على جميع العابر 5-7. هذا التجدد تبدأ الافراج عن ريتينال مفروق من الصباغ photoactivated ، مخلفين وراءهم opsin الاشتقاق البروتين. يتم تقليل بسرعة الإفراج عن جميع العابر الشبكية في رد فعل على جميع الاستفادة من NADPH العابر الريتينول ، ويجمع بين opsin الطازجة مع 11 — رابطة الدول المستقلة الشبكية جلبت الى الجزء الخارجي لإصلاح صبغة بصرية. ثم يتم نقل جميع العابر الريتينول من الجزء الخارجي والى الخلايا المجاورة من البروتين الناقل المتخصصة ريتينويد Interphotoreceptor تجليد (IRBP).
ويمكن استخدام التصوير مضان من خلايا مستقبلة للضوء واحد لدراسة علم وظائف الأعضاء وبيولوجيا الخلية. كاليفورنيا 2 + يمكن حساسة الأصباغ الفلورية يمكن استخدامها لفحص بالتفصيل التفاعل بين الجزء الخارجي كا 2 + التغيرات والاستجابة للضوء 12/08 فضلا عن دور الكالسيوم الجزء الداخلي 2 + مخازن في كا 2 + التوازن 13،14 . ويمكن أيضا أن تستخدم الأصباغ الفلورية لقياس تركيز المغنيسيوم 2 + 15 ، ودرجة الحموضة ، وكأثر من الغشاء المائي والمقصورات 16. أخيرا ، يمكن استخدام مضان الجوهرية للجميع عبر الريتينول (فيتامين أ) لرصد حركية من تشكيلها ، وإزالة خلايا مستقبلة للضوء في واحدة 17-19.
Protocol
Discussion
إذا لم يتم الحصول على الخلايا المعزولة صحية ، والمشكلة تكمن إما العزلة أو صحة شبكية العين أو مع تقطيع والخمسين. عادة ، بعد إزالة الجزء الأمامي من العين والجسم الزجاجي ، والشبكية ترفع بسهولة قبالة ظهارة الصباغ. إذا لم يكن ، في محاولة لقشر تشغيله ابتداء من محيط فنجان ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من منحة NEI EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y. Vertebrate Photoreceptors. Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in Vertebrate Photoreceptors. Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).
- Palczewski, K. G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin. Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
