Aquí descritos son protocolos que se utilizan para visualizar el proceso dinámico de la MG53 mediada por reparación de la membrana celular en todo el animal y en el nivel celular. Estos métodos se pueden aplicar para investigar la biología celular de volver a sellar la membrana plasmática y la medicina regenerativa.
Reparación de una lesión aguda de la membrana celular es un proceso elemental de la fisiología celular normal y defectuosa reparación de la membrana se ha relacionado con muchas enfermedades humanas degenerativas. El reciente descubrimiento de la MG53 como un componente clave de la maquinaria de volver a sellar la membrana permite una mejor comprensión molecular de la biología básica de la reparación de tejidos, así como para posibles aplicaciones traslacional en medicina regenerativa. Aquí se detallan los protocolos experimentales para explorar la función in vivo de la MG53 en la reparación de una lesión muscular a través de protocolos esfuerzo en tapiz rodante en modelos de ratón, para las pruebas de la membrana ex vivo la capacidad de reparación mediante la medición de entrada de un colorante en las fibras musculares aisladas, y para vigilar el proceso dinámico de tráfico de vesículas MG53-mediada y reparación de la membrana celular en las células cultivadas mediante microscopía confocal de células en vivo.
Carrera en cinta ergométrica es una metodología útil a proporcionar una carga de ejercicio para los animales tratados. Como una metodología para la medición de la función muscular o la capacidad de resistencia es un enfoque notablemente ruidoso que es difícil de ejecutar en forma consistente reproducible 8. En general, los tiempos hasta el agotamiento puede ser utilizado como un punto final para resolver las diferencias principales entre los grupos experimentales, tales como las que existen entre algunas líneas de octavos de final del ratón y los ratones de tipo salvaje 9. Manipulaciones experimentales que producen diferencias más sutiles, tales como algunos ensayos farmacéuticos, no puede resolver las diferencias por encima del ruido asociado a esta técnica. Con el fin de maximizar la reproducibilidad y la sensibilidad de estas técnicas es importante para mantener las condiciones para una sesión a otra muy de cerca. La hora del día los animales se ejercen, así como las condiciones de período de calentamiento utilizado, son factores importantes y debe permanecer constante de ensayo a otro.
Efectos de la tensión puede tener un impacto significativo en el diseño de los protocolos de rutina, como ciertas cepas de ratones puede funcionar durante mucho más tiempo en la cinta que otras cepas y responden de manera diferente al ejercicio de resistencia 10. Como pauta general, muchos ratones se podrá ejecutar total de 200-300 metros en un estudio de agotamiento con el aumento constante de la velocidad de la cinta (5 m / m velocidad inicial de 1 m / m añadido por cada minuto después del arranque). Para un ejercicio de resistencia de los ratones se puede ejecutar de 9 a 12 m / m durante 30 minutos dos o tres veces a la semana. Sin embargo, los estudios individuales por lo general requieren una optimización del protocolo para que coincida con las necesidades individuales de experimentación.
El procedimiento de los rayos UV-láser ha demostrado ser un método eficaz para medir la capacidad de reparación de la membrana de las fibras musculares esqueléticas 3,6,11. Un componente vital para el éxito de estos experimentos es el uso de las fibras musculares que sólo mostrar una apariencia recta, en forma de varilla con un patrón regular de estrías y un sarcolema suave que no parece arrugada. Si las fibras musculares de otro tipo son seleccionados daño de la membrana puede estar ya presente en las fibras y la interpretación de los resultados de estos experimentos pueden ser complicados. También es importante que la orientación de la fibra y la definición de la región irradiada que se definen en la Figura 1. Esto proporciona una lesión de tamaño reproducible, permitiendo así la comparación entre las fibras. Si la región definida de la lesión se encuentra por completo dentro de la fibra, una lesión, se creará en lugar de interrumpir el sarcolema. Además, el valor calculado para Df / F 0 es muy sensible a la región de interés seleccionados para la medición de la fluorescencia media. Un área de aproximadamente 200μm 2, adyacentes e incluyendo el sitio de la lesión, es la adecuada. A diferencia de la región definida por lesión, esta área debe estar completamente dentro de la fibra. Si se incluye el espacio fuera de la fibra, el área en blanco resultante se incrementará Df / 0 F en las fibras con la entrada de tinte poco tiempo que reduce Df / 0 F en las fibras con un fenotipo más grave. Esto disminuye la sensibilidad de la prueba, con lo que la comparación entre las fibras más difícil.
Para la prueba de daño micropipeta, el ángulo entre la micropipeta y un plato con fondo de cristal debe ser aproximadamente 45 grados con el fin de los daños efectivamente la membrana celular. Las células fueron elegidos por los daños micropipeta debe estar bien pegada al fondo del recipiente y de células redondeadas no debe ser utilizado desde más probable es que se separará después de meter micropipeta. Experimentos saponina permeabilzation son técnicamente menos exigentes y más rápido para llevar a cabo relativamente en comparación con los ensayos de penetración micropipeta. Sin embargo, existen varias limitaciones a los daños saponina, entre ellos el de una sola célula puede ser utilizado por plato desde la saponina se difundirá y daños en otras células en el plato.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |