Визуализация MG53-опосредованной клеточной мембраны Ремонт Использование В естественных условиях И В пробирке Системы

Summary

Описанные здесь протоколов, используемых для визуализации динамичный процесс MG53-опосредованной клеточной мембраны ремонт в целых животных и на клеточном уровне. Эти методы могут быть применены для исследования клеточной биологии плазмы опечатывания мембраны и регенеративной медицины.

Abstract

Ремонт острого повреждения клеточной мембраны является элементарный процесс нормальной клеточной физиологии и дефектных мембраны ремонт был связан со многими дегенеративных заболеваний человека. Недавнее открытие MG53, как одного из ключевых компонентов машины запечатывания мембраны позволяет лучше молекулярного понимания фундаментальной биологии восстановления тканей, а также для потенциальных поступательного применения в регенеративной медицине. Здесь мы подробно экспериментальных протоколов для исследования в естественных функций MG53 по ремонту повреждения мышц использованием беговой дорожке протоколов упражнений на мышах, для тестирования бывших естественных мембран ремонт мощностей путем измерения красителя вступления в изолированных мышечных волокон, а также для мониторинга динамического процесса из MG53-опосредованной торговли пузырьков и ремонта клеточных мембран в культуре клеток с использованием живой клетки конфокальной микроскопии.

Protocol

1. Беговой дорожке для выявления Степень повреждения мышц на мышах Установить угол поверхности беговой дорожки для использования во время работы протокола. Вообще, плоские уровне или угол между 7 ° и 15 ° градусов вниз или в гору не используется. Некоторые беговые дорожки имеют в интегральной аппарат для регулировки наклона, а другие требуют беговой дорожке, чтобы быть повышен с помощью других средств. Место лоток или синий площадку под лабораторию беговой дорожке, прежде чем положить животных в беговую дорожку для сбора отходов с животными во время работы протокола. Перед запуском мышей должна приспособиться к среде беговой дорожке. Это включает в себя размещение животных в беговой дорожке в течение 15 минут с электрической сетью с и двигателем ременной привод на поясе, но не двигаться (то есть со скоростью установлена ​​на уровне 0 м / с). Включите мотивационную сетку электрические. Интенсивность и частота импульсов, используемых, как правило, контролируется на беговых дорожках, но изменяется от одного производителя к другому. Как правило, максимальная интенсивность не обязан мотивировать мыши для запуска в то время как высокие частоты (по крайней мере раз в две секунды), будет способствовать соблюдению. Активировать беговой дорожке пояса, чтобы начать работы протокола. Начальная скорость около 5 м / мин должен быть использован для теплого периода за мышами. Скорость беговой дорожки может быть ускорен медленно, как правило, путем добавления 1-2 м / мин за каждую минуту после начала беговой дорожке. Соблюдение животных в большинстве протоколов может быть улучшена путем проведения серии коротких промежутков времени (5 минут) в теплой скорость от 3 до 10 дней до экспериментальной работы начинается. Острого истощения упражнения, как правило, связаны с увеличением скорости беговой дорожке со временем до максимальной скорости (как правило, <30 м / м) достигается и поддерживается до мышей проявлять признаки истощения. Критерии для оценки истощения варьироваться, но обычно включают в себя мышь тратит больше, чем в половине случаев по электрической сети или 5 последовательных секунд на электрическую сеть, не возвращаясь в беговой дорожке поверхности. После отдельных мышь исчерпаны он может быть удален от беговой дорожки и общее время работы могут быть записаны. Изменение угла беговой дорожке может быть использована при острых ходовых испытаний увеличить упражнения нагрузки (с углом в гору) или вызвать повреждение эксцентричных сокращений (с углом вниз), что слеза sarcolemmal мембраны мышечных волокон 1. Эванс синий краситель может быть введен в животных, прежде чем такие процедуры для использования в качестве гистологических красителей для выявления поврежденных мышечных волокон 2,3. Тренировка на выносливость под управлением протокола обеспечивают осуществление нагрузки для животного в течение длительного периода времени (до месяца), чтобы произвести реконструкцию мышцы или сердечно-сосудистой системы. Разминка процедура такая же, как и выше (шаг 1,5), однако максимальная скорость, как правило, ниже, а время работы может быть достаточно длинным (> 1 часа). После завершения работы мыши могут быть возвращены в свои клетки. Беговые дорожки обычно становятся сильно загрязнен в то время как мыши под управлением, в частности, в течение длительного протоколов. Надо чистить беговой дорожке, как правило, с 70% этанола спрей, после каждого использования. 2. Ex Vivo Пробирная мембранных Ремонт Емкость Изолированные мышечных волокон После УФ-лазерного разрушения Рассеките из поверхностного слоя сгибателей пальцев Brevis (FDB) мышцы от мыши пешком. Во-первых, сократить кожи единственным открытым в средней линии, заботясь, чтобы не повредить мышцы внизу, а затем сделать горизонтальными разрезами и снять кожу. Плоский белый сухожилия FDB мышцы (проксимальных сухожилий) можно увидеть прилагается к пяточной кости. Грубо говоря отдельные сухожилия от щипцов и порвать сухожилия вблизи места крепления, возьмите свободный сухожилия от щипцов и вытащите его осторожно, чтобы отдельные FDB от окружающих тканей при одновременном сокращении любой соединительной ткани, которые остаются прикрепленными. Увидев дистальные ветви сухожилия, чтобы отдельные цифры FDB могут быть удалены путем разрезания, где эти сухожилия подключиться к более глубокий слой мышц. Положите пучок FDB мышцы в 1 мл раствора коллагеназы предварительно нагревают до 37 ° С в 1,5 мл Eppendorf трубка, лента трубки в горизонтальной ориентации в 37 ° C орбитальный шейкер и потрясите на 200 оборотов в минуту в течение 65 мин. Время инкубации, возможно, придется скорректировать, чтобы обеспечить достаточную пищеварения, о чем свидетельствует появление изношен и бледный цвет мышц. Тщательно передачи переваривается FDB расслоения в 1,5 мкл трубки центрифуги содержащих ~ 600 мкл 2,5 Са 2 + через Tyrode 1 мл пипетки с разрезом конец, который имеет диаметр достаточно, чтобы позволить переваривается пучок легко проходят без сбоев. Аккуратно переверните трубку пожать свободных волокон от расслоения. Вырезать 30 мкл кончика пипетки, так что гiameter лишь немногим меньше, чем мышцы расслоением (между 15 – 20 мкм в диаметре) Использование пипетки, чтобы аккуратно нарисовать расслоения в пипетку и задвиньте его обратно в раствор.. Повторите этот процесс, пока большинство волокна в отрыве от расслоения. Смешайте отделена волокна хорошо, аккуратно поворота трубы, взять необходимую сумму и падение на стеклянным дном блюдо дельта T. Объем нагрузки будет меняться в зависимости от эффективности изоляции и ряд полезных волокон, которые необходимы на блюдо для конкретного протокола. Остальные волокна могут быть сохранены в трубке при температуре 4 ° С в течение примерно 6 часов для дополнительных исследований. Разрешить блюдо, чтобы сидеть спокойно в течение 5 минут. Это позволяет волокнам придерживаться стекла нижней части блюда. Место стекло дном блюдо на конфокальной микроскопии оснащена УФ лазера. Соблюдайте волокон при микроскопии в фазе> 100X увеличение, чтобы проверить наличие стандартного режима исчерченность и прямая, как стержень форму. Добавить FM1-43 или FM4-64 styrylpyridinium красителей 4 до решения конечной концентрации 2,5 мкМ 5. Чтобы вызвать повреждение волокна поместить его в окно, чтобы изображения волокна ориентирован на угол 45 ° от верхнего левого угла поля зрения в правом нижнем углу (рис. 1). Радиация 5×5 площадь пикселя (примерно 0.9μmx0.9μm) из плазматической мембраны с помощью УФ лазер (80 мВт и более, 351/364 нм) выставлена ​​на максимальный уровень мощности в течение 5 секунд. Облученной области должны разделить плазматической мембраны, то есть половина 5×5 коробка должна быть внутри волокна, а остальные должны быть вне волокна (рис. 1). Захват изображений красителя вступления в волокно с интервалом в 5 секунд до 5 минут. Повторите шаг 2,8 не более чем на 3 волокон на блюдо, в качестве флуоресцентного красителя в конечном итоге будет эндоцитарных в волокно и осложнить любые данные анализа. После 3-волокна нового блюда должны быть приготовлены из шага 2.5. Анализ данных, вычисляя изменение интенсивности флуоресценции (f / F 0) между каждым захваченном кадре, чтобы измерить количество красителя записи. Это требует измерения среднего значения флуоресценции площадь около 200 мкм 2 с использованием программного обеспечения для анализа, таких как общедоступной ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Для сравнения между волокнами, следующий расчет должны быть сделаны для каждого кадра: f / F 0, где F 0-средняя флуоресценции области интереса в первом захваченном кадре (т = 0; до травмы), и является ΔF Изменение флуоресценции каждого последующего кадра (FF 0). 3. Живой клетки конфокальной микроскопии для мониторинга динамичный процесс ремонта клеток мембранные Микропипетки были сделаны из PYREX капилляры. Капиллярной был сделан на съемник микропипетки и тянет заранее заданной программе (Heat = 695; Потяните = 50; Vel .= 55; Время = 250). Микропипетки был прикреплен к 3 оси (XYZ) микроманипулятора. Клетки трансфекции плазмидой ДНК с помощью обычных методов стеклянным дном блюдо дельта T. СМИ должны быть переключены на 2,5 Са 2 + Tyrode буфер перед экспериментами начать. Стекло блюд, содержащих трансфекции клетки были помещены на лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с 40X 1.3NA целью погружения на нефть. Острый живой повреждения клеток проводили путем вставки микропипетки в клеточную мембрану, а затем быстро убрать микропипетки из клетки 3,6. Последовательные изображения в реальном времени ячейки были получены с интервалом в 1,54 сек / кадр. Для сапонин индуцированных анализа нарушения мембраны, 0,005% сапонин (Sigma) в 2,5 Са 2 + Tyrode буфер перфузии по самотечного специально собранном перфузии системы 7. Перфузии скорость составляет примерно 1 мл / мин и перфузии наконечник должен быть размещен непосредственно над ячейки в образ. 4. Представитель Результаты: Представитель фильм работает беговой дорожке мыши могут быть сделаны во время съемок. Фильм будет иллюстрировать снижается под управлением мощностью mg53-/ – мышей из-за повреждения скелетных мышц. Степень повреждения, вызванные УФ-лазерного разрушения протоколе указано выше, зависит от мощности мембраны ремонт волокна проанализированы. Эта способность зависит от генотипа мыши, из которой был выделен волокна, внеклеточных условиях, и любые изменения в экспрессии белка (трансфекции или инфекции). Нормальная дикая типа волокна позволят небольшим, чтобы уменьшиться красителя запись (рис. 2а). Мышечных волокон происходит от mg53-/ – мышей с ослабленной мощности ремонт мембраны будет отображать более значительным ввода красителя в волокне (рис. 2б). Типичные результаты микроэлектрода травмы показать транслокации MG53 содержащих Vesiчастиц в месте повреждения. Рис 3а и 3б показывают GFP-MG53 трансфицированных C2C12 myotubes повреждены вставки микропипетки в клеточной мембране. В камере до повреждения микропипетки, GFP-MG53 расположен на обоих плазматической мембраны и цитоплазмы 3. После микропипетки проникновения, GFP-MG53 содержащей пузырьки двинулся к повреждению сайтов (как указано стрелкой). 3, в показывает, GFP-MG53 трансфицированных C2C12 миобластов обрабатывают 0,005% сапонина, моющих средств, которые могут permeabilize плазматической мембраны. По сапонин лечения, GFP-MG53 перемещаться из цитозоля к мембране клетки. Вайследер и соавт. Рисунок 1. Выравнивание волокон и определение травмы регионе. Правильная ориентация изолированных мышечных волокон в поле зрения и определение травмы региона показано на рисунке. Вайследер и соавт. Рисунок 2. Ультрафиолетовых лучей лазерной FDB волокна. Изображения показывают волокна до травмы (0 сек, слева) и на 200 секунд после травмы (справа). Волокна из диких мышей типа (а) иметь незначительные травмы. Волокна из мышей с ослабленной мембраны ремонт (б) позволяют больше красителя, чтобы войти. Вайследер и соавт. Рисунок 3. Микроэлектродные и сапонин ущерб культуре клеток. Изображения показывают C2C12 myotubes (а, б) и C2C12 миобластов (с) до травмы (вверху) и после травмы (внизу). Клетки, пострадавших в результате микроэлектрода (а, б) показывают, MG53 транслокации травмы сайтов (стрелки). Клетки обрабатывали сырье (с) показывают, MG53 транслокации на клеточную мембрану.

Discussion

Беговая дорожка бег полезной методологии на обеспечение осуществления нагрузки у подопытных животных. Как методологии для измерения функции мышц или выносливость это общеизвестно шумных подход, который трудно выполнить в последовательно воспроизводимый модой ^8. В общем, времени до изнеможения могут быть использованы в качестве конечной точки для решения основных различий между экспериментальными группами, например, между некоторыми нокаутом мышей линии и мышей дикого типа ^9. Экспериментальные манипуляции, которые производят более тонкие различия, например, некоторые фармацевтические исследования, не может урегулировать разногласия выше шума, связанного с этой техникой. В целях обеспечения максимальной воспроизводимости и чувствительности этих методов важно для поддержания условий для сессии к сессии очень внимательно. Времени суток животных осуществляются, а также теплый период наблюдения условия использования являются важными факторами, и он должен оставаться последовательной от испытания к испытанию.

Штамм эффекты могут оказать существенное влияние на дизайн беговой дорожке протоколы некоторых штаммов мышей может работать намного больше времени на беговой дорожке, чем другие штаммы и по-разному реагируют на выносливость ^10. В качестве общей рекомендации, многие мыши будет иметь возможность запускать 200-300 метров в общем истощении исследования с постоянным увеличением скорости беговой дорожке (5 м / м с начальной скоростью 1 м / м добавили за каждую минуту после старта). За упражнения на выносливость мышей могут быть запущены в возрасте от 9 до 12 м / м в течение 30 минут два или три раза в неделю. Тем не менее, отдельные исследования, как правило, требуют некоторой оптимизации протокола в соответствии с индивидуальными потребностями экспериментальной.

УФ-лазерного разрушения процедура показали, чтобы быть эффективным методом для измерения мощности мембраны ремонт скелетные мышечные волокна ^3,6,11. Один жизненно важным компонентом для успеха этих экспериментов является использование только мышечные волокна, которые отображают прямые, стержень формы внешности с шаблоном регулярного страт и гладкой сарколеммой, что не появляется морщинистой. Если другие мышечные волокна выбираются мембраны ущерб может уже находиться в этих волокон и интерпретация результатов этих экспериментов могут быть сложными. Важно также, что ориентация волокон и определения области облучения быть как показано на рис 1. Это обеспечивает травмы воспроизводимых размера, что позволяет сравнение между волокнами. Если определена область травмы целиком лежит внутри волокна, внутренняя травма будет создан, а не нарушая сарколеммой. Кроме того, значение, рассчитанное для f / F ₀ является очень чувствительной к интересующей нас области, отобранных для измерения средней флуоресценции. Площадь около 200 мкм ^2, прилегающих к и в том числе места повреждения, является целесообразным. В отличие от области, определяемой за вред, эта область должна полностью лежать в пределах волокна. Если включить пространства вне волокна, в результате пустой области увеличится f / F ₀ в волокнах с небольшим красителя запись при одновременном снижении f / F ₀ в волокнах с более тяжелыми фенотипа. Это приводит к уменьшению чувствительности анализа, что делает сравнение между волокнами сложнее.

Для анализа повреждений микропипетки, угол между микропипетки и блюдо со стеклянным дном должно быть примерно 45 градусов, с тем чтобы эффективно повреждение клеточной мембраны. Клетки были выбраны за ущерб, микропипетки должны быть плотно прикреплена к нижней части блюда и округлые клетки не должна использоваться так, скорее всего, они будут отделяться после микропипетки тыкать. Эксперименты Saponin permeabilzation менее технически сложных и сравнительно быстрого выполнения по сравнению с микропипетки проникновения анализов. Однако Есть несколько ограничений сапонин повреждения, в том числе, что только одна ячейка может быть использована на чашку с сапонин будет диффундировать и повредить другие клетки в этом блюде.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Rodent treadmill	Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent
70 % ethanol	ISC Bioexpress
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors	World Precision Instruments
2 mg/ml collagenase type I	Sigma
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm)	Sigma
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm)	Sigma
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick or equivalent
Delta TPG Dish	Fisher Scientific	1207133
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope	Zeiss
FM1-43 or FM4-64 dyes	Invitrogen
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm	PYREX	Part No. 9530-2
Micropipette puller	Sutter Instruments	model P-97
3 axis micromanipulator	Narishige	MHW-3
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	BioRad	MHW-3
Saponin	Sigma	47036