שתוארו כאן הם השתמשו בפרוטוקולים כדי להמחיש את התהליך הדינמי של תיקון MG53 בתיווך קרום התא בבעלי חיים שלם ברמה התאית. שיטות אלה ניתן ליישם כדי לחקור את הביולוגיה של התא פותחת הממברנה הפלסמטית ורפואה רגנרטיבית.
תיקון של פגיעה חריפה על קרום התא היא תהליך יסודי של הפיזיולוגיה הסלולר נורמלי, פגום לתיקון קרום נקשר הרבה מחלות אנושיות ניווניות. התגלית האחרונה של MG53 כמרכיב עיקרי של המנגנון פותחת הממברנה מאפשרת הבנה טובה יותר של מולקולרי הביולוגיה הבסיסית של תיקון רקמות, כמו גם עבור יישומים translational פוטנציאליים רפואה רגנרטיבית. כאן אנו בפירוט את פרוטוקולי הניסוי לבחינת תפקוד vivo של MG53 במצב של פציעה בשריר תוך שימוש בפרוטוקולים תרגיל הליכון על מודלים העכבר, לבדיקת vivo לשעבר קרום יכולת לתקן על ידי מדידת ערך צבע לתוך סיבי שריר מבודדים, לניטור תהליך דינמי סחר MG53 בתיווך שלפוחית ואת קרום התא לתקן תאים בתרבית באמצעות מיקרוסקופ תא חי confocal.
ריצה הליכון היא מתודולוגיה שימושי על מתן עומס התרגיל של בעלי חיים שטופלו. כפי מתודולוגיה עבור מדידת תפקוד השרירים או יכולת סיבולת היא גישה רועש לשמצה שקשה לבצע באופן עקבי לשחזור 8. באופן כללי, פעמים כדי תשישות יכולה לשמש נקודת הסיום כדי לפתור הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי, כגון אלה בין כמה קווי עכבר נוקאאוט ועכברים סוג בר 9. מניפולציות ניסויית המייצרים הבדל דק יותר, כגון כמה ניסויים התרופות, לא יכול לפתור חילוקי מעל הרעש הקשורות טכניקה זו. על מנת למקסם את reproducibility ורגישות של טכניקות אלה חשוב לשמור על תנאים מושב למושב מאוד הדוק. הזמן של היום חיות ימומשו, כמו גם תקופת התנאים להתחמם בשימוש, הם גורמים חשובים וצריכים להישאר עקבי ממשפט למשפט.
השפעת מתח יכול להיות השפעה משמעותית על עיצוב של פרוטוקולים הליכון כמו זנים מסוימים של עכברים יכול לרוץ הרבה יותר זמן על ההליכון מאשר זנים אחרים מגיבים באופן שונה תרגיל סיבולת 10. כקו מנחה כללי, עכברים רבים יוכלו לרוץ 200-300 מטר הכולל במחקר תשישות עם עלייה מתמדת במהירות של ההליכון (5 מ '/ מ' מהירות ראשוני עם 1 מ '/ מ' מוסף עבור כל דקה אחרי ההתחלה). עבור תרגיל סיבולת העכברים ניתן לרוץ בין 9-12 מ '/ מ' במשך 30 דקות 2 או 3 פעמים בשבוע. עם זאת, מחקרים בודדים בדרך כלל דורשים אופטימיזציה של פרוטוקול כדי להתאים לצרכים ניסיוניים בודדים.
ההליך-UV לייזר נזק הוכח להיות שיטה יעילה למדידת תיקון קרום קיבולת של סיבי שריר השלד 3,6,11. אחת מרכיב חיוני להצלחת ניסויים אלה היא להשתמש בסיבי השריר היחיד להציג מראה ישר, בצורת מוט עם דפוס קבוע של פסי ו sarcolemma חלק שאינו מופיע מקומט. אם סיבי השריר אחרים נבחרו נזק הקרום עשוי להיות כבר נוכח אלה סיבים הפרשנות של תוצאות ניסויים אלה עשוי להיות מסובך. חשוב גם כי הכיוון של הסיבים ואת ההגדרה של האזור מוקרן להיות מוגדרת כ באיור 1. זה מספק פגיעה בגודל לשחזור, ובכך מאפשר השוואה בין הסיבים. אם האזור מוגדר של פגיעה נמצא לחלוטין בתוך הסיב, פגיעה פנימית תיווצר במקום לשבש את sarcolemma. בנוסף, ערך מחושב עבור ΔF / F 0 רגיש מאוד באזור של עניין שנבחרו מדידת הקרינה מתכוון. שטח של כ 200μm 2, סמוך ובכלל במקום הפציעה, הוא המתאים. בניגוד לאזור שהוגדר עבור פציעה, אזור זה צריך לשקר לחלוטין בתוך הסיב. אם תכלול שטח מחוץ סיבים, שטח ריק וכתוצאה מכך יגדל ΔF / F 0 בסיבים עם כניסה לצבוע מעט תוך הפחתת ΔF / F 0 בסיבים עם פנוטיפ חמור יותר. זה מקטין את הרגישות של assay, ובכך השוואה בין סיבי קשה יותר.
עבור assay את הנזק micropipette, את הזווית בין micropipette והתחתון צלחת זכוכית צריך להיות כ 45 מעלות על מנת ביעילות נזק של קרום התא. התאים נבחרו נזק micropipette יש לצרף בחוזקה אל החלק התחתון של התבשיל תאים מעוגלים לא אמור לשמש מאז סביר להניח שהם תנתק לאחר micropipette תוקעת. Permeabilzation ניסויים Saponin פחות תובענית מבחינה טכנית יחסית מהר לבצע לעומת micropipette מבחני חדירה. עם זאת, ישנן מספר מגבלות לנזק saponin, ובכלל זה רק תא אחד יכול לשמש לכל צלחת מאז saponin יהיה מפוזר נזק לתאים אחרים בכלי זה.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |