الموصوفة هنا البروتوكولات المستخدمة لتصور عملية ديناميكية من MG53 بوساطة غشاء الخلية إصلاح في الحيوانات كلها وعلى المستوى الخلوي. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحقيق في بيولوجيا الخلايا من إعادة عزل غشاء البلازما والطب التجديدي.
إصلاح الضرر الحاد إلى غشاء الخلية هي عملية عنصري الفيزيولوجيا الخلوية العادية ، والذي تم ربطه إصلاح خلل الغشاء لكثير من الأمراض التنكسية الإنسان. الاكتشافات الحديثة لMG53 كعنصر أساسي للغشاء آلات إعادة عزل يسمح لفهم أفضل للبيولوجيا الجزيئية الأساسية لإصلاح الأنسجة ، فضلا عن التطبيقات المحتملة متعدية في مجال الطب التجديدي. نحن هنا من التفصيل البروتوكولات التجريبية لاستكشاف في وظائف الجسم الحي من MG53 لاصلاح اصابة في العضلات باستخدام بروتوكولات ممارسة مفرغه على نماذج الماوس ، لاختبار قدرة الغشاء فيفو السابقين إصلاح عن طريق قياس دخول الى صبغ ألياف العضلات المعزولة ، ورصد عملية ديناميكية الاتجار حويصلة MG53 بوساطة إصلاح غشاء الخلية والخلايا المستزرعة في استخدام الخلايا الحية المجهري متحد البؤر.
تشغيل مفرغه هي منهجية مفيدة في توفير تحميل ممارسة للحيوانات المعالجة. كمنهجية لقياس وظيفة العضلات أو القدرة على التحمل وهو نهج صاخبة المعروف أن من الصعب تنفيذ بطريقة استنساخه باستمرار 8. عموما ، يمكن استخدام مرات لاستنفاد باعتبارها نقطة النهاية لحسم الخلافات الرئيسية بين المجموعات التجريبية ، مثل تلك التي بين بعض خطوط الماوس خروج المغلوب والفئران البرية نوع 9. التلاعب التجريبية التي تنتج الفرق أكثر دهاء ، مثل بعض التجارب الدوائية ، قد لا حل الخلافات فوق الضوضاء المصاحبة لهذه التقنية. من أجل تحقيق أقصى قدر من استنساخ وحساسية هذه التقنيات من المهم للحفاظ على شروط الدورة إلى الدورة عن كثب. الوقت من اليوم تمارس هذه الحيوانات ، وكذلك الظروف حتى الفترة الحارة المستخدمة ، هي عوامل مهمة ويجب ان تبقى ثابتة من المحاكمة إلى محاكمة.
يمكن أن الآثار سلالة يكون له أثر كبير على تصميم بروتوكولات مفرغه كما سلالات معينة من الفئران يمكن تشغيلها لفترة أكثر من ذلك بكثير في حلقة مفرغة من السلالات الأخرى ، وتستجيب بشكل مختلف لممارسة التحمل 10. كمبدأ عام ، فإن العديد من الفئران أن تكون قادرة على تشغيل 200-300 متر الإجمالي في دراسة استنفاد مع التزايد المستمر في سرعة مفرغه (5 م / م الأولية مع سرعة 1 م / م المضافة لكل دقيقة بعد بدء). قد لممارسة التحمل يمكن تشغيل الفئران بين 9-12 م / م لمدة 30 دقيقة 2 أو 3 مرات في الأسبوع. ومع ذلك ، فإن الدراسات الفردية وعادة ما يتطلب بعض التحسين على بروتوكول لمباراة تجريبية الاحتياجات الفردية.
وقد تبين أن الإجراء أضرار الأشعة فوق البنفسجية الليزر ليكون وسيلة فعالة لقياس القدرة إصلاح غشاء من ألياف العضلات والهيكل العظمي 3،6،11. واحد عنصرا حيويا لنجاح هذه التجارب لاستخدام الألياف العضلية التي تعرض فقط ، ورود على شكل مستقيم مع ظهور نمط منتظم من التصدعات وغمد الليف العضلي الملساء التي لا تظهر التجاعيد. إذا يتم تحديد ألياف العضلات الأخرى قد يؤدي إلى تلف الغشاء يكون موجودا بالفعل في هذه الألياف وتفسير نتائج هذه التجارب قد تكون معقدة. من المهم أيضا أن تكون على النحو المحدد في اتجاه الألياف وتعريف المنطقة المشع في الشكل 1. هذا يوفر إصابة حجم استنساخه ، مما يسمح بالمقارنة بين الألياف. إذا كانت المنطقة التي تعرف تماما من الاصابة تقع داخل الألياف ، سيتم إنشاء إصابة داخلية بدلا من تعطيل غمد الليف العضلي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن القيمة المحسوبة لΔF / F 0 حساس جدا في المنطقة ذات الاهتمام المحدد لقياس يعني مضان. تبلغ مساحتها حوالي 200μm 2 ، والمحاذية للموقع بما في ذلك الإصابات وغير مناسبة. على عكس المنطقة المحددة للإصابة ، يجب أن هذه المنطقة تقع بالكامل داخل الألياف. إذا قمت بتضمين الفضاء خارج الألياف ، فإن منطقة فارغة مما أدى زيادة ΔF / 0 F في الألياف مع إدخال الصبغة قليلا وفي الوقت نفسه تخفيض ΔF / 0 F في الألياف مع النمط الظاهري أكثر شدة. هذا يقلل من حساسية الفحص ، مما يجعل المقارنة بين ألياف أكثر صعوبة.
لمقايسة micropipette الضرر ، ينبغي أن الزاوية بين micropipette وعاء زجاجي القاع تكون حوالي 45 درجة من أجل الضرر بفعالية في غشاء الخلية. وقد تم اختيار الخلايا للتلف micropipette يجب أن يرفق بإحكام على الجزء السفلي من الطبق ، وينبغي ألا يتم استخدام خلايا مدورة منذ الأرجح أنها سوف تنفصل بعد micropipette بدس. تجارب permeabilzation سابونين هي أقل تطلبا من الناحية الفنية وأسرع نسبيا مقارنة لأداء micropipette المقايسات الاختراق. ومع ذلك ، هناك العديد من القيود على الضرر سابونين ، بما في ذلك ويمكن استخدام خلية واحدة فقط لكل طبق منذ سابونين ومنتشر وتلف خلايا أخرى في هذا الطبق.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |