Клик-химии основан метод, который позволяет оперативно, неинвазивным и надежный маркировки алкин с метками гликанов в данио эмбрионов описано. Фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов в поздней стадии гаструляции были обследованы в этом исследовании.
Abstract
Изображений гликанов в естественных условиях была недавно включена с использованием bioorthogonal стратегии репортер химической обработкой клеток или организмов с азид или алкин с метками моносахаридов 1, 2. Изменение моносахаридов, обрабатывается механизм биосинтеза гликана, включаются в гликоконъюгатов поверхности клетки. Bioorthogonal теги или азид алкин затем позволить ковалентные сопряжения с флуоресцентных зондов для визуализации, или с близостью зонды для обогащения и glycoproteomic анализа. Этот протокол описывает процедуры, как правило, используется для неинвазивной визуализации фукозилированных гликанов в данио эмбрионов, в том числе: 1) микроинъекции одноклеточного эмбриона сцене с ВВП-5-alkynylfucose (ВВП-FucAl), 2) маркировка фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов с азид-сопряженных флуорофоров с помощью биосовместимых Cu (I)-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC), и 3) изображений с помощью конфокальной микроскопии 3. Метод, описанный здесь, может быть легко распространено на себе другие классы гликанов, например гликанов содержащие сиаловой кислоты 4 и N-ацетилгалактозамина5, 6, в развивающихся данио и других живых организмов.
Protocol
1. Сбор яиц и Dechorionation Сбор и передача данио яиц блюдо Петри 35 мм, удалить столько воды, сколько возможно, а затем добавьте 1 мг / мл Pronease Е в E3 среда эмбриона (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 мМ MgSO 4, рН = 7,4), чтобы переварить хориона. Через 3-5 минут, слияние блюдо в …
Discussion
<p class="jove_content"> Изображений биомолекул<em> В естественных условиях</em> Обеспечивает необходимую понимание их биологической активности в родной среде. В этом видео показано, как маркировка фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов осуществляется microinjecting один-клеточной стадии…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здоровья (GM093282 для PW; 3U54AI057158-06S1 с RDS) и ввод в эксплуатацию средств из колледжа Альберта Эйнштейна медицины.
Jiang, H., Feng, L., Soriano del Amo, D., Seidel III, R. D., Marlow, F., Wu, P. Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (52), e2686, doi:10.3791/2686 (2011).