Een klik-chemie gebaseerde methode die het mogelijk maakt voor de snelle, niet-invasieve, en robuuste etikettering van alkyn-tagged glycanen in zebravis embryo's wordt beschreven. Gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van de zebravis embryo's in de late gastrulatie stadium waren afgebeeld in deze studie.
Imaging glycanen in vivo is onlangs ingeschakeld met een bioorthogonal chemische verslaggever strategie door het behandelen van cellen of organismen met een azide-of alkyn-tagged monosachariden 1, 2. De gewijzigde monosacchariden, verwerkt door de glycan biosynthetische machines, worden opgenomen in het celoppervlak glycoconjugaten. De bioorthogonal azide of alkyn labels laat vervolgens covalente conjugatie met fluorescerende probes voor visualisatie, of met affiniteit probes voor verrijking en glycoproteomic analyse. Dit protocol beschrijft de procedures doorgaans gebruikt voor niet-invasieve beeldvorming van de gefucosyleerde glycanen in zebravis embryo's, waaronder: 1) micro-injectie van een-cellig stadium embryo's met een BBP-5-alkynylfucose (BBP-FucAl), 2) de etikettering gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van zebravis embryo's met azide-geconjugeerde fluoroforen via biocompatibel Cu (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC), en 3) beeldvorming door confocale microscopie 3. De hier beschreven methode kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere klassen van glycanen, bv. glycanen bevat sialinezuur 4 en N-acetylgalactosamine 5, 6, bij de ontwikkeling van de zebravis en in andere levende organismen te visualiseren.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (GM093282 naar PW; 3U54AI057158-06S1 tot RDS) en het opstarten van fondsen van Albert Einstein College of Medicine.
Name of the reagent | Company | Catalog number |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 |
Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 |
dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 |
Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 |
Glass bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C |