השיטה מבוססת על כימיה המאפשר תיוג, מהיר פולשנית, ויציב של alkyne-tagged glycans עוברי דג הזברה מתואר. Glycans Fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה בשלב מאוחר gastrulation היו הדמיה במחקר זה.
Abstract
Glycans Imaging in vivo לאחרונה מופעל באמצעות אסטרטגיה bioorthogonal הכתב על ידי טיפול כימי בתאים או אורגניזמים עם מונוסכרידים אזיד או alkyne-tagged 1, 2. מונוסכרידים שונה, מעובד על ידי המנגנון biosynthetic glycan, ישולבו glycoconjugates פני התא. תגיות bioorthogonal אזיד או alkyne מכן לאפשר נטיה קוולנטיים עם בדיקות ניאון להדמיה, או עם בדיקות זיקה העשרה ניתוח glycoproteomic. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור הדמיה לא פולשנית של glycans fucosylated עוברי דג הזברה, כולל: 1) microinjection של אחד התאים עוברים שלב עם תמ"ג-5-alkynylfucose (תמ"ג-FucAl), 2) תיוג glycans fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה עם אזיד-מצומדות fluorophores דרך Cu ביולוגית (אני)-catalyzed אזיד-alkyne cycloaddition (CuAAC), ו 3) הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal 3. השיטה המתוארת כאן ניתן להרחיב בקלות לדמיין בסוגים אחרים של glycans, glycans למשל המכילים חומצה sialic 4 ו N-acetylgalactosamine5, 6, דג הזברה מתפתח בתוך אורגניזמים חיים אחרים.
Protocol
1. ביצה איסוף Dechorionation איסוף והעברת ביצי דג הזברה על צלחת פטרי 35mm, להסיר כמו מים רב ככל האפשר ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ג / מ"ל E Pronease במדיום העובר E3 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0.33 mM MgSO 4, pH = 7.4) לעכל את סיסית….
Discussion
<p class="jove_content"> הדמיה ביומולקולות<em> In vivo</em> מספק תובנות קריטיות הפעילות הביולוגית שלהם בסביבות מולדתם. בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך תיוג של glycans fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה הוא הבין ידי microinjecting חד תא עוברי הבמה עם תוצר FucAl וכן הצמידה השני צעד fluorophore דרך CuAAC BTTES בתיווך ביולוגית<sup> 3</sup>. תיוג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (GM093282 אל PW; 3U54AI057158-06S1 כדי RDS) וקרנות ההפעלה של אלברט איינשטיין לרפואה.
Jiang, H., Feng, L., Soriano del Amo, D., Seidel III, R. D., Marlow, F., Wu, P. Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (52), e2686, doi:10.3791/2686 (2011).