표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략
Summary
고효율을위한 신뢰할 수있는 방법<em> 체외에서</em> 표현과 교양 인간의 배아 신장 세포에 재조합 전압 – 게이 티드 이온 채널 (HEK – 293T)의 후속 electrophysiological 기록.
Abstract
체외의 표현과 교양 인간의 배아 신장 세포에 재조합 전압 – 게이 티드 이온 채널 electrophysiological 기록에 (HEK – 293T) 유비 쿼터스 연구 전략이다. 그들은 인접 세포와 접촉으로 인한 혼란함을 주죠 효과없이 electrophysiological 레코딩을위한 수 있도록 서로 접촉되지 않도록 HEK – 293T 세포가 낮은만큼 밀도에 유리 coverslips에 도금해야합니다. Transfected 채널은 또한 소음 수준 이상의 감지 전류를 전체 세포 패치 클램프 레코딩을위한 플라즈마 막 높은 효율로 표현합니다. Heterologous 이온 채널은 종종 ° C transfection 후 적절한 막 표현을 달성하기 위해 28에서 긴 배양 기간을 필요로하지만,이 온도에서 셀 coverslip 부착 및 막 안정성의 손실을가 증가하고 있습니다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 transfect 및 플레이트 HEK – 293T 세포에 최적화된 전략을 개발했습니다. 이 방법은 세포가 28에서 비교적 높은 confluency에서 transfected하고, incubated 있어야 ° 적절한 이온 채널 단백질 표현을 할 수 있도록 배양 기간 후 transfection 변화를위한 C. Transfected 세포는 다음 유리 coverslips에 도금 및 37 ° C coverslips 및 멤브레인 restabilization에 엄격한 세포 부착을 허용 몇 시간에 대한 incubated 수 있습니다. 전지는 곧 도금 후 녹음하거나 ° C 더 배양을 위해 28 전송할 수 있습니다. 우리는 28의 초기 부화 ° C, transfection 후 있지만 도금하기 전에는 일반적으로 플라즈마 막에서 잘 표현하지 heterologous 이온 채널의 효율적인 표현을위한 열쇠입니다 것을 발견했습니다. 긍정적으로 transfected, 교양 세포는 단지 상류 내부 ribosome 항목 사이트 및 eGFP 코딩 시퀀스의 cDNA 재조합 이온 채널을 포함하는 bicistronic 벡터 (예 : pIRES2 – EGFP)에서 표현 공동 표현 eGFP 또는 eGFP에 의해 식별됩니다. 전체 세포 패치 클램프 녹음 전문 장비를 필요 플러스 borosilicate 유리 광택 기록 전극과 L 자형 접지 전극의 crafting. 이온 채널의 약리학 연구를 마약 배달 직접 녹음 요리로 마약을 micropipetting에 의해, 또는 microperfusion 또는 기록된 세포 이상 약물 솔루션의 중단 흐름을 생산 비중 흐름 시스템을 사용하여 얻을 수 있습니다.
Protocol
Discussion
설명 프로토콜 및 솔루션을 사용하여 전체 셀 전류를 기록할 수있다는 것은 transfection가 성공하고 원하는 전압 – 게이 티드 이온 채널이나 이온 채널 단지는 세포막에서 상당한 수량에 참석하는 것을 나타냅니다. 세포가 적극적으로 transfected (즉, 형광 녹색)하지만 기록 전류, 28에서 추가 시간 ° C가 제대로 포장하고 세포막에 삽입되는 채널 단백질을 허용해야 할 수 있습니다이 없습니다되어?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 자연 과학에서 JDS에 디스커버리 운영 부여에 의해 지원되었다 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC), NSERC 알렉산더 그레이엄 벨 캐나다의 대학원 장학금 (박사) (A. Senatore)을하고 심장과 뇌졸중 재단, 그랜트 # 6284 NA – 인 – 에이드.
Materials
| Material | Company | Catalogue Number | Comment |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
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- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , (2003).
- Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
