שיטה אמינה היעילה ביותר<em> במבחנה</em> הביטוי הקלטה אלקטרו הבאות של רקומביננטי מתח מגודרת תעלות יונים של האדם תאים בתרבית כליה עובריים (HEK-293T).
בביטוי במבחנה אלקטרו הקלטה של מתח מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב האדם תאים בתרבית כליה עובריים (HEK-293T) היא אסטרטגיית המחקר נמצא בכל מקום. HEK-293T התאים חייב להיות מצופה על coverslips זכוכית בצפיפות מספיק נמוך כדי שהם לא נמצאים במגע זה עם זה על מנת לאפשר הקלטה אלקטרו ללא תופעות בלבול כתוצאה ממגע עם תאים סמוכים. ערוצי transfected צריך גם לבטא עם יעילות גבוהה על קרום התא עבור כל הקלטה תאים תיקון מהדק של זרמים לגילוי מעל רמות הרעש. תעלות יונים Heterologous לעיתים קרובות דורשים תקופות דגירה ארוך 28 מעלות צלזיוס לאחר transfection על מנת להשיג ביטוי הולם קרום, אבל יש להגדיל את ההפסדים של הידבקות התא coverslip ויציבות הממברנה בטמפרטורה זו. כדי לעקוף בעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה מותאם transfect צלחת HEK-293T תאים. שיטה זו דורשת כי התאים להיות transfected בבית confluency גבוה יחסית, מודגרות ב 28 ° C לפרקי הדגירה שלאחר transfection כדי לאפשר ביטוי נאות ערוץ יון חלבון. תאים transfected הם מצופה ומשם coverslips זכוכית מודגרות ב 37 ° C למשך מספר שעות, המאפשרת התקשרות תא נוקשה coverslips ו restabilization הממברנה. תאים ניתן להקליט זמן קצר לאחר ציפוי, או ניתן להעביר 28 מעלות צלזיוס במשך הדגירה נוספת. אנו מוצאים כי הדגירה הראשונית ב 28 ° C, לאחר transfection אבל לפני ציפוי, הוא המפתח לביטוי יעיל של תעלות יונים Heterologous שבדרך כלל אינם מבטאים היטב את הממברנה הפלסמטית. Transfected חיובי, תאים בתרבית מזוהים שיתוף הביע eGFP או eGFP הביע מן וקטור bicistronic (למשל pIRES2-EGFP) המכיל את ערוץ יון רקומביננטי cDNA רק נגד הזרם של אתר כניסה פנימי הריבוזום ואת רצף eGFP קידוד. Whole-cell מהדק הקלטה התיקון דורש ציוד מיוחד, בתוספת crafting של אלקטרודות הקלטה מלוטשת בצורת אלקטרודות לקרקע ממשטח הזכוכית בורוסיליקט. משלוח סמים כדי ללמוד את פרמקולוגיה של תעלות יונים יכולה להיות מושגת על ידי ישירות micropipetting סמים לתוך צלחת ההקלטה, או באמצעות microperfusion או זרימת הכבידה מערכות המייצרות זרמים רצוף של פתרון התרופה על תאים מוקלט.
היכולת להקליט כל תא זרמים באמצעות פרוטוקולים תיאר ופתרונות מציין כי transfection היה מוצלח וכי הרצוי מתח מגודרת תעלות יונים או ערוץ מתחמי יון נמצאים עם כמויות משמעותיות על קרום התא. התאים צריכה להיות transfected חיובי (כלומר פלואורסצנטי ירוק), אך לא זרמים לצריבה, זמן נוסף על 2…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק דיסקברי ההפעלה JDS של מדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר (NSERC) של קנדה, NSERC אלכסנדר גרהם בל קנדה מלגות לתארים מתקדמים (דוקטורט) (א 'Senatore) וקרן לב ושבץ, גרנט -In-Aid NA # 6284.
Material | Company | Catalogue Number | Comment |
pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |