高効率、信頼性の高い方法<em> in vitroで</em>発現と培養ヒト胚性腎細胞における組換え電位依存性イオンチャネル(HEK – 293T)のその後の電気生理学的記録。
in vitro発現と培養ヒト胚性腎細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録(HEK – 293T) におけるユビキタス研究の戦略です。彼らは、隣接セルとの接触による交絡影響することなく電気生理学的記録を可能にするために、互いに接触していないようにHEK – 293T細胞は、十分に低い密度でカバーガラス上にプレーティングする必要があります。トランスフェクトされたチャネルは、ノイズレベルを超える検出可能な電流の細胞全体のパッチクランプ記録のための細胞膜に高効率で表現しなければなりません。異種イオンチャネルは、多くの場合、十分な膜発現を達成するために28℃でトランスフェクション後にCを長い潜伏期間が必要ですが、この温度で細胞カバースリップの接着と細胞膜の安定性の損失が高まっている。この問題を回避するために、我々は、トランスフェクションとプレートHEK – 293T細胞に最適化された戦略を開発した。このメソッドは、セルが28で比較的高いコンフルエントでトランスフェクトされた、とインキュベートされている必要があります°十分なイオンチャネルタンパク質の発現を可能にするために潜伏期間後のトランスフェクションを変えるためのC。トランスフェクトした細胞をガラスカバースリップ上に播種し、37℃でカバーガラスと膜のrestabilizationに硬い細胞接着を可能にするいくつかの時間、インキュベートする。細胞はすぐにメッキの後に記録することができます、または° C、さらにインキュベーションを28に転送することができます。我々は28時の初期インキュベーション℃で、トランスフェクション後、メッキの前には、通常は細胞膜でも発現しない異種イオンチャネルの効率的な発現のための鍵であることがわかります。積極的にトランスフェクション、培養細胞は、単に上流の内部リボソーム侵入部位およびEGFPをコードする配列のcDNA組換えイオンチャネルを含むバイシストロンベクター(例えばpIRES2 – EGFP)から発現共発現EGFPまたはeGFPので識別されます。ホールセルパッチクランプ記録は、特殊な装置を必要とする、加えて洗練された記録電極とホウケイ酸ガラスからL字型の接地電極の策定。イオンチャネルの薬理学を研究する薬物送達は、直接録音皿に薬をmicropipettingことにより、またはmicroperfusionまたは記録された細胞を介して薬液の中断のないストリームを生成する重力流システムを使用することによって達成することができます。
記載されているプロトコルとソリューションを使用して、細胞全体の電流を記録するためにできることは、トランスフェクションが成功したことを、所望の電圧依存性イオンチャネルやイオンチャネル複合体は細胞膜でかなりの量で存在していることを示しています。細胞は積極的にトランスフェクト(すなわち蛍光緑)が記録可能な電流、28で追加のタイム° Cが適切にパッケージ化し?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、グラント、カナダの自然科学と工学研究評議会(NSERC)、NSERCアレクサンダーグラハムベルカナダ大学院奨学金(博士課程)(A. Senatoreまで)と心臓脳卒中財団からJDSに検出動作グラントによってサポートされていました#6284 NA -補助。