优化转染的HEK - 293T细胞中的表达和重组的电压门控离子通道的电生理记录策略
Summary
高效可靠的方法<em>在体外</em>表达和随后的重组中培养的人类胚胎肾细胞电压门控离子通道（HEK – 293T）的电生理记录。
Abstract
在体外表达和重组在体外培养的人类胚胎肾细胞的电压门控离子通道的电生理记录（HEK – 293T）是一个无处不在的研究策略。 HEK – 293T细胞必须镀在足够低的密度，使他们在相互接触不是为了让电生理记录没有因接触与相邻的细胞混杂影响到盖玻片。转染的渠道也必须在全细胞膜片钳记录检测到的电流噪音水平以上的质膜与高效率的表达。异种离子通道往往需要长的潜伏期，在28 ° C转染后，以达到足够的细胞膜表达，但有越来越多的盖玻片细胞粘附和膜的稳定性，在此温度下的损失。要绕过这个问题，我们开发了一种优化策略，以转染和板的HEK – 293T细胞。这种方法需要在一个相对较高的汇合，被转染细胞，并培养28 °不同的潜伏期后转染，以便有足够的离子通道蛋白的表达转染细胞，然后接种到盖玻片培养在37℃为好几个小时，这对于刚性细胞附着到盖玻片和膜restabilization允许。细胞可记录后不久，电镀，或可转移至28 ° C的进一步孵化。我们发现，最初的潜伏期在28 ° C转染后，但在此之前，电镀，高效表达异源离子通道，一般不会在细胞膜表达的关键。正转，培养的细胞共同表达的eGFP或的eGFP确定重组离子通道的cDNA内部核糖体进入位和EGFP编码序列的上游，从双顺反子载体（如pIRES2 – EGFP）表达。全细胞膜片钳记录需要专门的设备，加上抛光的记录电极和“L”形的接地电极，高硼硅玻璃制作。药物输送到离子通道药理学研究的，可以实现直接micropipetting进录音碟药物，或使用microperfusion或重力流系统记录细胞产生不间断的药物溶液流。
Protocol
Discussion
能够记录使用所描述的协议和解决方案的全细胞电流显示，转染成功，所需的电压门控离子通道或离子通道复合物在细胞膜的大量。细胞应该积极转（即绿色荧光），但没有录制的电流，更多的时间在28 ° C可要求允许必须包装妥当，并插入到细胞膜上的通道蛋白。注意，长期孵化28 ° C时，将会导致细胞分离从盖玻片，膜的破坏和堆积死细胞碎片，使膜片钳记录更具挑战性的。所有在本议定?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了发现工作津贴，从自然科学和捷工程研究理事会（NSERC），加拿大，NSERC亚历山大格雷厄姆贝尔加拿大研究生奖学金（博士）（A.塞纳托雷）和心脏与中风基金会，格兰特在援助NA＃6284。
Materials
| Material | Company | Catalogue Number | Comment |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
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- Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
