Se presenta un método para preparar cortes organotípicos de embriones de ratón mitad de la gestación para el cultivo y la imagen de lapso de tiempo de extensión del nervio periférico.
Para muchos fines, el cultivo de embriones de ratón ex vivo como rebanadas organotípicos es deseable. Por ejemplo, contamos con una línea de ratones transgénicos (tauGFP) en la que es exclusivamente la versión mejorada de la proteína verde fluorescente (EGFP) se expresa en todas las neuronas del sistema nervioso en desarrollo de una central y periférico, lo que permite la posibilidad de tanto en cine como la inervación de las patas delanteras y de manipular este proceso con las técnicas farmacológicas y genéticas 2. El parámetro más importante en el cultivo exitoso de las culturas rebanada tal es el método por el cual los cortes están preparados. Después de extensas pruebas de una variedad de métodos, hemos encontrado que un vibratomo es el mejor dispositivo posible para cortar los embriones de forma que de manera rutinaria como resultado una cultura que muestra la viabilidad en un período de varios días, y lo más importante, se desarrolla en una época de manera específica. Para mediados de la gestación de embriones, lo que incluye la consecuencia normal de los nervios espinales de la médula espinal y los ganglios de la raíz dorsal de sus objetivos en la periferia y la correcta determinación de tejido óseo y muscular.
En este trabajo se presenta un método para el procesamiento de embriones todo el día embrionario (E) E10 a E12 en 300 a 400 rebanadas micrómetro para el cultivo en un estándar de cultivo de tejidos incubadora, que pueden ser estudiados por hasta dos días después de la preparación rebanada. Fundamental para el éxito de este enfoque es el uso de un vibratome para cortar cada embrión de agarosa embebidos. Esto es seguido por el cultivo de los cortes en la cultura inserta Millicell membrana colocada sobre un pequeño volumen de medio, lo que resulta en una técnica de cultivo de la interfaz. Una camada con un promedio de siete embriones habitualmente produce por lo menos 14 sectores (2-3 porciones de la región extremidad anterior por embrión), que varía ligeramente debido a la edad de los embriones, así como el grosor de las rodajas. Alrededor del 80% de las rebanadas de cultivo muestran consecuencia del nervio, que puede ser medido througout el período de cultivo 2. Los resultados representativos utilizando la línea de ratón tauGFP se demuestran.
En una amplia comparación de los métodos para preparar cultivos de embriones rebanada de embriones de ratón mitad de la gestación (E10 – E12), hemos observado que un vibratomo produce sin lugar a dudas los resultados más confiables con respecto tanto a la viabilidad general de las culturas y la reproducibilidad de los los patrones de derivación del nervio. Por el contrario, las rebanadas de preparados con un helicóptero del tejido McIlwain 3 resultó ser completamente inviable. Lo que originalmente se …
Los autores reconocen la fuente original de la idea de llevar a cabo la cultura rebanada en cinco embriones de ratón. Queremos agradecer a Joachim Kirsch por su generoso apoyo científico y Degen Anna para que actúen como nuestros gofer durante el rodaje. Este trabajo fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) y la Universidad de Heidelberg (Excelencia racimo redes celulares).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
Dissection tools | FST | various | ||
L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
Shortened firepolished pipettes | ||||
DMEM | GIBCO | 41966 | ||
FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
analySIS | Soft Imaging System | |||
Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
HEPES | Roth | 9105.2 | ||
Glucose | Sigma | G7021 | ||
x4 objective | Olympus | PL series | ||
x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |