Summary

عضوي النمط من الثقافة شريحة GFP - معربا عن أجنة الفئران لريال مدريد في الوقت ثمرة تصوير الأعصاب الطرفية

Published: March 29, 2011
doi:

Summary

نقدم طريقة لتحضير شرائح عضوي النمط من أجنة فئران في منتصف الحمل للزراعة والتصوير مرور الوقت ، من ثمرة الأعصاب الطرفية.

Abstract

لأغراض كثيرة ، وزراعة الأجنة الحية الماوس السابقين وشرائح عضوي النمط غير مرغوب فيه. على سبيل المثال ، ونحن توظيف خط الماوس المعدلة وراثيا (tauGFP) الذي يعبر حصرا نسخة مطورة من البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) في جميع الخلايا العصبية في تطور الجهاز العصبي المركزي والمحيطي 1 ، مما يسمح لكلا احتمال الفيلم من تعصيب وforelimb والتلاعب هذه العملية مع تقنيات والدوائية الجينية 2. المعلمة الأكثر أهمية في زراعة ناجحة لشريحة الثقافات مثل هذا الأسلوب الذي يتم إعداد الشرائح. بعد اختبارات مكثفة من مجموعة متنوعة من الأساليب ، أننا وجدنا أن vibratome هو الجهاز الأمثل لشريحة الأجنة بحيث يؤدي بشكل روتيني في ثقافة الذي يوضح جدوى على مدى أيام عدة ، والأهم من ذلك أنه في عصر تتطور بطريقة محددة. في منتصف الحمل الأجنة ، ويشمل هذا نتاج طبيعي للأعصاب العمود الفقري من الحبل الشوكي والعقد الجذرية الظهرية إلى أهدافهم في محيط والتصميم السليم للأنسجة العضلات والهيكل العظمي.

في هذا العمل ، فإننا نقدم وسيلة لمعالجة الأجنة كلها اليوم الجنينية (E) E10 E12 لفي 300 — 400 ميكرومتر شرائح لزراعة الأنسجة في حاضنة الثقافة الموحدة ، والتي يمكن دراستها لمدة تصل إلى يومين بعد إعداد شريحة. حاسمة بالنسبة لنجاح هذا النهج هو استخدام vibratome لشريحة كل جنين agarose جزءا لا يتجزأ. ويتبع ذلك عن طريق زراعة شرائح عند إدراج Millicell غشاء الثقافة وضعت بناء على حجم صغير من المتوسط ​​، مما أدى إلى واجهة تقنية الثقافة. القمامة واحدة بمتوسط ​​7 أجنة بشكل روتيني وتنتج ما لا يقل عن 14 شرائح (2-3 شرائح من منطقة جنين في forelimb) ، والذي يختلف قليلا بسبب عمر الأجنة وكذلك سمك الشرائح. حوالي 80 ٪ من الشرائح المثقفة تظهر ثمرة العصبية ، والتي يمكن قياسها على زراعة 2 througout الفترة. وأظهرت النتائج ممثل باستخدام سطر tauGFP الماوس.

Protocol

الجزء 1 : الاستعداد للتشريح والتثقيف. إعداد لوحات 10 سم ، وزراعة الأنسجة مع تشريح المتوسطة (DMEM ، و 25 ٪ HBSS 1X ، و 25 ٪ مصل بقري جنيني والجلوكوز بنسبة 0.5 ٪ ، 1 الجلوتامين ملي و 2.5 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.3) و 3 سم Millicell – CM – 0.4 ميكروم?…

Discussion

في المقارنة واسعة من الأساليب لإعداد الثقافات شريحة الجنينية من أجنة فئران في منتصف الحمل (E10 — E12) ، وقد لاحظنا أن vibratome تنتج دون شك نتائج الأكثر موثوقية فيما يتعلق جدوى على حد سواء العام للثقافات واستنساخ أنماط ثمرة العصبية. في المقابل ، أعدت شرائح الأنسجة باستخدام ا?…

Acknowledgements

الكتاب يعترف المصدر الأصلي للفكرة لأداء ثقافة شريحة على أجنة الفئران 5. نود أن نعترف يواكيم كيرش للحصول على الدعم السخي والعلمية ديجين آنا لدينا بوصفها gofer أثناء التصوير. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (دويتشه Forschungsgemeinschaft : Sonderforschungsbereich 488 ، Teilprojekt B7/B9) ، وجامعة هايدلبرغ (التميز الكتلة الشبكات الخلوية).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
HBSS 10x   GIBCO 14180  
Dissection tools   FST various  
L.M.P. agarose   Invitrogen 15517-022  
Whatmann paper   Whatman Int. 3030917  
Shortened firepolished pipettes        
DMEM   GIBCO 41966  
FBS   GIBCO 10270-106  
Pen Strep   GIBCO 15140  
L-glutamine 100x   GIBCO 25030  
Vibratome   Microm International GmbH HM 650 V  
Fluorescent microscope   Olympus BX61WI  
analySIS   Soft Imaging System    
Millicell-CM inserts   Millipore PICMORG 50  
10 cm culture plates   Greiner Bio-One 633171  
LOCTITE 406   Henkel 142580  
Razor blades   Thermo Fisher none  
Dissecting microscope   Nikon SMZ800  
HEPES   Roth 9105.2  
Glucose   Sigma G7021  
x4 objective   Olympus PL series  
x10 objective   Olympus UPLFL –PH series  
Filter   Olympus U-MNIBA2  
CCD camera   Soft Imaging System SIS F-View II  
Equipment for heated chamber   Leica CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171  

References

  1. Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
  2. Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
  3. Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
  4. Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
  5. Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).

Play Video

Cite This Article
Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (49), e2309, doi:10.3791/2309 (2011).

View Video