אנו מציגים שיטה להכין פרוסות organotypic של אמצע ההיריון עוברי עכברים הדמיה טיפוח זמן לשגות תולדה של עצבים היקפיים.
Abstract
למטרות רבות, טיפוח vivo עוברי עכבר לשעבר כמו פרוסות organotypic רצוי. לדוגמה, אנו מעסיקים קו עכבר מהונדס (tauGFP) שבו גרסה משופרת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) באה לידי ביטוי באופן בלעדי את כל הנוירונים של מערכת העצבים המרכזית לפיתוח היקפי 1, המאפשר את האפשרות לצלם גם את העצבוב של forelimb ו לתפעל את התהליך הזה עם טכניקות תרופתי ו גנטית 2. הפרמטר הקריטי ביותר לגידול מוצלח של תרבויות פרוסה כזו היא השיטה בה את פרוסות מוכנים. לאחר בדיקה מקיפה של מגוון שיטות, מצאנו כי vibratome הוא המכשיר הטוב ביותר הפרוסה עוברים כך שהם שגרתי תוצאה בתרבות מדגים יכולת הקיום על פני תקופה של מספר ימים, והכי חשוב, מפתחת בעידן באופן ספציפי. עבור אמצע ההריון עוברים, זה כולל את תוצאה נורמלית של העצבים בעמוד השדרה של חוט השדרה ואת הגרעינים השורש הגבי ליעדם בפריפריה וקביעת תקין של רקמת שריר השלד.
בעבודה זו, אנו מציגים שיטה לעיבוד עוברים כל יום עובריים (E) E10 ל E12 לתוך 300-400 מיקרומטר פרוסות לגידול בתרבית רקמה רגילה החממה, אשר ניתן ללמוד עד יומיים לאחר הכנה פרוסה. קריטי להצלחה של גישה זו הוא השימוש vibratome על כל פרוסה העובר agarose-מוטבע. זה ואחריו הטיפוח של פרוסות על קרום Millicell מוסיף תרבות דגש על נפח קטן של המדיום, והתוצאה היא טכניקה תרבות ממשק. המלטה אחת עם ממוצע של 7 עוברים באופן שגרתי מייצר לפחות 14 פרוסות (2-3 פרוסות של האזור forelimb לכל העובר), אשר משתנה מעט עקב גיל העוברים כמו גם עובי הפרוסות. כ -80% את פרוסות תרבותי להראות תוצאה עצב, אשר ניתן למדוד througout 2 תקופת culturing. תוצאות נציג באמצעות שורת עכבר tauGFP הם הפגינו.
Protocol
חלק 1: הכנת לחתוך culturing. הכן 10 ס"מ תרבות צלחות רקמה עם חיתוך בינוני (DMEM, 25% HBSS 1x, 25% בסרום שור עוברית, גלוקוז 0.5%, גלוטמין 1 מ"מ, 2.5 HEPES מ"מ, pH 7.3) ו – 3 ס"מ Millicell-CM-0.4 מיקרומטר תרבות מוסיף קרום ושומרים החממה ב 37 ° C ו 5% CO 2.</…
Discussion
לשם השוואה מקיפה של שיטות להכין תרבויות פרוסה עובריים של אמצע ההיריון עוברי עכברים (E10 – E12), ראינו כי vibratome מייצר ללא ספק את התוצאות הכי אמין לגבי הכדאיות הן הכוללת של תרבויות ושל שחזור של תוצאה העצב דפוסי. לעומת זאת, פרוסות מוכן באמצעות מסוק רקמות McIlwain 3 התבררה invia…
Acknowledgements
המחברים מודים המקור לרעיון לבצע התרבות פרוסה על עוברי עכברים 5. ברצוננו להודות יואכים קירש תמיכה מדעית נדיב אנה Degen עבור מתנהג כמו גופר שלנו במהלך הצילומים. עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר הגרמנית (דויטשה Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) של אוניברסיטת היידלברג (Cluster אקסלנס רשתות סלולריות).
Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (49), e2309, doi:10.3791/2309 (2011).