We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.
Voor vele doeleinden, de teelt van muizenembryo's ex vivo als organotypische plakken is wenselijk. Bijvoorbeeld, gebruiken we een transgene muis lijn (tauGFP), waarin de uitgebreide versie van het groen fluorescerend eiwit (EGFP) uitsluitend wordt uitgedrukt in alle neuronen van de ontwikkelingslanden centraal en perifeer zenuwstelsel 1, waardoor de mogelijkheid om zowel film als de innervatie van de voorpoot en om dit proces te manipuleren met farmacologische en genetische technieken 2. De meest kritische parameter in de succesvolle teelt van dergelijke slice culturen is de methode waarmee de schijfjes worden bereid. Na uitgebreide testen van een verscheidenheid aan methoden, we hebben ontdekt dat een vibratome is de best mogelijke apparaat om de embryo's zodanig dat ze routinematig resulteren in een cultuur die levensvatbaarheid over een periode van enkele dagen, en vooral laat zien slice, ontwikkelt zich in een tijdperk -specifieke manier. Voor mid-zwangerschap embryo's omvat dit de normale uitgroei van de spinale zenuwen uit het ruggenmerg en de achterwortelganglia om hun doelen in de periferie en de juiste bepaling van de skelet-en spierweefsel.
In dit werk, presenteren we een methode voor het verwerken van hele embryo's van embryonale dag (E) E10 tot E12 in 300 tot 400 micrometer plakjes voor de teelt in een standaard weefselkweek incubator, die kunnen worden bestudeerd voor tot twee dagen na de slice voorbereiding. Cruciaal voor het succes van deze aanpak is het gebruik van een vibratome aan elk agarose-embedded embryo slice. Dit wordt gevolgd door de teelt van de schijfjes op Millicell cultuur membraan inserts geplaatst op een klein volume van het medium, wat resulteert in een interface cultuur techniek. Een nest met een gemiddelde van 7 embryo's produceert gewoonlijk minstens 14 sneetjes (2-3 plakjes van de voorpoot regio per embryo), die een beetje varieert vanwege de ouderdom van de embryo's en aan de dikte van de plakken. Ongeveer 80% van de gekweekte plakjes tonen zenuw uitgroei, die kan worden gemeten througout het kweken periode 2. Representatieve resultaten met behulp van de muis tauGFP lijn worden gedemonstreerd.
In een uitgebreide vergelijking van methoden voor het embryonale slice culturen van mid-dracht muis embryo's (E10 – E12) voor te bereiden, hebben we vastgesteld dat een vibratome produceert zonder twijfel de meest betrouwbare resultaten met betrekking tot zowel de algemene leefbaarheid van de culturen en de reproduceerbaarheid van de zenuw uitgroei patronen. In tegenstelling, plakjes bereid met behulp van een tissue McIlwain chopper 3 bleek te zijn volledig inviable. We oorspronkelijk in dienst een guillo…
De auteurs erkennen de originele bron voor de idee om slice cultuur uit te voeren op muizenembryo's 5. We willen graag Joachim Kirsch erkennen voor genereuze wetenschappelijke ondersteuning en Anna Degen voor het fungeren als onze gofer tijdens het filmen. Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) en de Universiteit van Heidelberg (Excellence Cluster mobiele netwerken).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
Dissection tools | FST | various | ||
L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
Shortened firepolished pipettes | ||||
DMEM | GIBCO | 41966 | ||
FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
analySIS | Soft Imaging System | |||
Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
HEPES | Roth | 9105.2 | ||
Glucose | Sigma | G7021 | ||
x4 objective | Olympus | PL series | ||
x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |