Summary

Antijen Özgül In Vivo Killing Testi

Published: November 09, 2010
doi:

Summary

Birçok enfeksiyonları güçlü bir CTL yanıtı ortaya çıkarmak, fakat bazen yanıt hücrelerinin miktarı patojenin kontrol etmek için orantılı değildir<sup> 1</sup>. CTL kaliteli bir önlem özellikle öldürmek için yeteneklerini<sup> 2</sup>. Hedef hücrelerin KAKE etiketleme bu CTL yanıt kalitesini araştırmak için kullanılabilir<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.

Abstract

Carboxyfluorescein diasetat succinimidyl ester (KAKE) kolay ve hızlı bir şekilde in vivo soruşturma ilgi bir hücre popülasyonu etiket kullanılabilir. Bu etiketleme klasik çoğalması ve göç çalışması için kullanılır olmuştur. Burada sunulan yöntem, epitop KAKE etiketli hedef hücreleri 4-6 hayatta kalma ve öldürme bakmak için evlatlık transferinden sonra, zaman çizelgesi kısaltılmış var. Miktarları yanıltıcı olabilir gibi spesifik CD8 + T hücre klonu öldürme seviyesi, kalite yanıt gösterebilir. CD8 + T hücreleri, sitokin üretimi ve öldürme 7,8 düşüş zaman içinde işlevsel olarak tükenmiş olabilir Özgül. Ayrıca, belirli CD8 + T hücre klonlar TCR özgüllükleri 9 farklı yanı sıra diğerleri gibi öldürmek olmayabilir. Etkili Hücre aracılı bağışıklık (CMI), antijenler, T hücreleri yanıt yeterli sayıda sadece üreten tespit değil, aynı zamanda işlevsel olarak sağlam bir yanıt T hücreleri olmalıdır. Burada iki peptid BALB / c farelerde spesifik T hücre klonları yüzde hücre özel öldürme değerlendirir.

Protocol

1. Hedef Özel Efektör CTL'lerin Bağışıklama ortaya çıkartılması (Gün 0) Hedef sistemi: başlamadan önce, belirli bir efektör üzerine karar verebilir. Klasik bir in vivo CTL tahlil Bu örnekte, spesifik CD8 + T hücreleri ortaya çıkarmak için saflaştırılmış bir peptid bağışıklama kullanabilirsiniz. Hedef sistemi: Aynı peptid singeneik hedef hücreleri belirli bir efektör yaratarak darbe olacaktır. Alternatif olarak, özel etkileyiciler ve hedefleri elde etmek için tü…

Discussion

KAKE döl 10,11 arasında nispeten eşit böler, çünkü bu testte, klonal genişleme de dahil olmak üzere hücrelerin proliferatif kapasitesi araştırmak için değiştirilebilir. Örneğin tetramers ve biyoparlaklık 13, KAKE etiketleme ile kombine edilebilir hipoteze göre daha uygun olabilir yöntemleri diğer hücre izleme, var olmasına rağmen, hücre göçü 6,12 araştırmak için KAKE etiketleme kullanmak da mümkün.

PE de işe yaramayabilir ise…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bianca MOTHE Carla Oseroff ve Marie-France DelGuercio immünolojik testleri ve fare kullanımı için beni tanıştırdığı için teşekkür etmek istiyorum. GA Splitter laboratuarda çalışma NIH hibe 1-RO1-AI-073.558, GLRCE hibe 1-U54-AI-057.153, BARD ABD-3829-06 tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1 mm glass beads   Biospec Products 11079110  
70 μm cell strainer   BD Falcon 352350  
96-well plate   Costar 3799  
Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant   Pacific Immunology n/a  
DMSO   Sigma D-5879  
FBS   GIBCO 16000-077  
FC 500 Flow Cytometer   Beckman Coulter n/a  
Kontes glass tissue grinder   Kontes 885300-0015  
Mini Beadbeater   Biospec Products n/a  
Needle   B-D 305175  
Parafilm “M”   Pechiney Plastic Packaging PM992  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 157-8  
PBS   GIBCO 10010-023  
PharmLyse lysing reagent   BD Biosciences 555899  
RPMI 1640   GIBCO 11875-093  
Syringe   B-D 309602  
Vybrant CFSE Kit   Invitrogen (Molecular Probes) V12883  

References

  1. Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
  2. Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
  3. Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
  4. Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
  5. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  6. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
  7. Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
  8. Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
  9. Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
  10. Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .

Play Video

Cite This Article
Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells. J. Vis. Exp. (45), e2250, doi:10.3791/2250 (2010).

View Video