Summary

Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta

Published: November 09, 2010
doi:

Summary

Molte infezioni provocano una forte risposta CTL, ma a volte, la quantità di cellule rispondono non è correlata al controllo del patogeno<sup> 1</sup>. Una misura della qualità CTL è la loro capacità di uccidere specificamente<sup> 2</sup>. Etichettatura CFSE di cellule bersaglio può essere utilizzato per indagare questa qualità CTL risposta<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.

Abstract

Carboxyfluorescein diacetato succinimidile estere (CFSE) può essere utilizzato per etichettare facilmente e rapidamente una popolazione di cellule per un esame più vivo. L'etichettatura è stata classicamente utilizzato per studiare la proliferazione e la migrazione. Nel metodo presentato qui, abbiamo accorciato la timeline dopo il trasferimento adottivo di guardare la sopravvivenza e l'uccisione di epitopo specifiche cellule bersaglio CFSE etichettato 4-6. Il livello di uccidere specifiche di una T CD8 + clone di cellule in grado di indicare la qualità della risposta, in quanto la loro quantità può essere fuorviante. Specifiche cellule T CD8 + può diventare funzionale esaurito nel tempo con un calo della produzione di citochine e uccidendo 7,8. Inoltre, alcuni cloni di cellule CD8 + T non può uccidere così come gli altri con diverse specificità TCR 9. Efficace per l'immunità cellulo-mediata (CMI), devono essere identificati antigeni che producono non solo un numero adeguato di risposta delle cellule T, ma anche funzionale, robusto cellule T risponde. Qui valutare l'uccisione delle cellule specifiche per cento dei due cloni T peptide specifico delle cellule in topi BALB / c.

Protocol

1. Suscitando CTL effettori target specifici di Immunizzazione (giorno 0) Prima di iniziare, decidere un effettore specifico: sistema di destinazione. In questo esempio di un classico test in vivo CTL, useremo una immunizzazione peptide purificato per suscitare specifiche cellule T CD8 +. Il peptide stesso sarà utilizzato per impulso delle cellule bersaglio singenici, creando un effettore specifico: sistema di destinazione. In alternativa, si può scegliere di utilizzare patogeno intero o proteine ?…

Discussion

Questo test può essere modificato per indagare la capacità proliferativa delle cellule, tra cui l'espansione clonale, perché CFSE divide equamente tra progenie relativamente 10,11. E 'anche possibile utilizzare l'etichettatura CFSE per studiare la migrazione delle cellule 6,12, anche se ci sono altre cellule tracciamento metodi che possono essere più appropriato a seconda delle ipotesi, per esempio tetrameri e bioluminescenza 13, che può anche essere combinato con l'…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorrei ringraziare Bianca Mothe, Carla Oseroff, e Marie-France DelGuercio per avermi fatto conoscere saggi immunologici e gestione del mouse. Il lavoro nel laboratorio di GA Splitter è finanziato dal NIH concedere 1-RO1-AI-073558, GLRCE concedere 1-U54-AI-057153, e BARD USA-3829-06.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1 mm glass beads   Biospec Products 11079110  
70 μm cell strainer   BD Falcon 352350  
96-well plate   Costar 3799  
Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant   Pacific Immunology n/a  
DMSO   Sigma D-5879  
FBS   GIBCO 16000-077  
FC 500 Flow Cytometer   Beckman Coulter n/a  
Kontes glass tissue grinder   Kontes 885300-0015  
Mini Beadbeater   Biospec Products n/a  
Needle   B-D 305175  
Parafilm “M”   Pechiney Plastic Packaging PM992  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 157-8  
PBS   GIBCO 10010-023  
PharmLyse lysing reagent   BD Biosciences 555899  
RPMI 1640   GIBCO 11875-093  
Syringe   B-D 309602  
Vybrant CFSE Kit   Invitrogen (Molecular Probes) V12883  

References

  1. Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
  2. Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
  3. Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
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Cite This Article
Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells. J. Vis. Exp. (45), e2250, doi:10.3791/2250 (2010).

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