Summary

Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Published: November 09, 2010
doi:

Summary

De nombreuses infections provoquent une forte réponse CTL, mais parfois, la quantité de cellules répondant n'est pas en corrélation au contrôle de l'agent pathogène<sup> 1</sup>. Une mesure de la qualité de CTL est leur capacité à tuer spécifiquement<sup> 2</sup>. CFSE étiquetage des cellules cibles peuvent être utilisées pour enquêter sur cette qualité réponse CTL<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.

Abstract

Carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) peut être utilisé facilement et rapidement l'étiquette d'une population cellulaire d'intérêt pour l'enquête in vivo. Cet étiquetage a été classiquement utilisé pour étudier la prolifération et la migration. Dans la méthode présentée ici, nous avons raccourci les délais, après le transfert adoptif de regarder la survie et la mort de cellules CFSE épitope spécifique cible marquée 4-6. Le niveau de destruction spécifique d'un clone cellulaire T CD8 + peuvent indiquer la qualité de la réponse, que leur quantité peut être trompeur. Spécifiques cellules T CD8 + peuvent devenir fonctionnellement épuisées au cours du temps avec une baisse de la production de cytokines et de tuer 7,8. En outre, certains clones CD8 + des lymphocytes T ne peut pas tuer ainsi que d'autres avec différentes spécificités TCR 9. Pour immunité à médiation cellulaire efficace (CMI), les antigènes doivent être identifiés qui produisent non seulement un nombre suffisant de répondre cellules T, mais aussi fonctionnellement robustes cellules T répondant. Ici nous évaluons la destruction des cellules spécifiques de deux pour cent peptide spécifique des clones de lymphocytes T dans souris Balb / c.

Protocol

1. Solliciter la cible des CTL spécifiques effectrices par la vaccination (jour 0) Avant de commencer, décider d'un effecteur spécifique: le système cible. Dans cet exemple d'un classique in vivo de CTL dosage, nous allons utiliser une vaccination peptide purifié à susciter spécifiques des cellules T CD8 +. Le même peptide sera utilisé pour les cellules cibles d'impulsion syngéniques, la création d'un effecteur spécifique: le système cible. Alternativement, vous pouvez ch…

Discussion

Ce dosage peut être modifié pour enquêter sur la capacité proliférative des cellules, y compris l'expansion clonale, parce CFSE divise de façon relativement égale parmi les descendants 10,11. Il est également possible d'utiliser l'étiquetage CFSE pour enquêter 6,12 migration cellulaire, mais il existe d'autres cellules de traçage des méthodes qui peuvent être plus appropriés en fonction de votre hypothèse, pour les tétramères exemple et bioluminescence 13,</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Je tiens à remercier Bianca Mothe, Carla Oseroff, et Marie-France DelGuercio pour me présenter à des tests immunologiques et de manipulation de la souris. Le travail dans le laboratoire de GA Splitter est financé par les NIH-RO1 subvention de 1-AI-073 558, GLRCE subvention de 1-U54-AI-057 153, et Bard US-3829-06.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1 mm glass beads   Biospec Products 11079110  
70 μm cell strainer   BD Falcon 352350  
96-well plate   Costar 3799  
Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant   Pacific Immunology n/a  
DMSO   Sigma D-5879  
FBS   GIBCO 16000-077  
FC 500 Flow Cytometer   Beckman Coulter n/a  
Kontes glass tissue grinder   Kontes 885300-0015  
Mini Beadbeater   Biospec Products n/a  
Needle   B-D 305175  
Parafilm “M”   Pechiney Plastic Packaging PM992  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 157-8  
PBS   GIBCO 10010-023  
PharmLyse lysing reagent   BD Biosciences 555899  
RPMI 1640   GIBCO 11875-093  
Syringe   B-D 309602  
Vybrant CFSE Kit   Invitrogen (Molecular Probes) V12883  

References

  1. Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
  2. Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
  3. Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
  4. Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
  5. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  6. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
  7. Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
  8. Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
  9. Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
  10. Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .

Play Video

Cite This Article
Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells. J. Vis. Exp. (45), e2250, doi:10.3791/2250 (2010).

View Video