Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula
Summary
Nós fornecemos um protocolo detalhado para preparar células primárias dissociada<em> Drosophil</em> A embriões. A capacidade de realizar a perturbação RNAi eficaz, juntamente com outros métodos de imagem molecular, bioquímica e celular permitirá que uma variedade de questões a serem abordadas na<em> Drosophila</em> Pilhas.
Abstract
Aqui nós descrevemos um método para a preparação e a cultura de células primárias dissociada de embriões Drosophila gástrula. Em suma, uma grande quantidade de embriões de moscas encenado jovens e saudáveis são recolhidos, esterilizados, e depois fisicamente dissociada em uma suspensão única célula usando um homogeneizador de vidro. Depois de ser semeadas em placas de cultura ou slides câmara em uma densidade adequada em meio de cultura, essas células podem diferenciar em vários tipos de células morfologicamente-distintas, que podem ser identificadas por seus marcadores celulares específicos. Além disso, apresentamos as condições para o tratamento destas células com fita dupla (ds) RNAs para provocar knockdown do gene. RNAi em células de Drosophila eficiente primário é realizado por simplesmente banhar as células do dsRNA contendo meio de cultura. A capacidade de realizar perturbação RNAi eficaz, juntamente com outros molecular, bioquímica, análises de imagens de células, permitirá uma série de perguntas a serem respondidas em células de Drosophila primária, especialmente aquelas relacionadas ao músculo diferenciadas e células neuronais.
Protocol
Discussion
O padrão de desenvolvimento de culturas primárias de células Drosophila pode variar muito, possivelmente devido a diversas variáveis durante o processo primário de células de preparação. Primeiro de tudo, voa usado para postura de ovos devem ser jovens (dentro de uma semana de idade) e saudável (livre de infecção viral ou bacteriana). Embriões não fertilizados ou infectado devem ser evitados, já que são inúteis e células derivadas de embriões não os pode diferenciar e só vai sobreviver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB foi apoiado pelo Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-1702. JZ foi apoiado pelo NIH / NIGMS Fellowship GM082174 F32-02. NP é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S3652 | ||
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | ||
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I-6634 | ||
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | ||
| #25 US standard testing sieve | VWR | 57334-454 | ||
| #45 US standard testing sieve | VWR | 57334-462 | ||
| #120 US standard testing sieve | VWR | 57334-474 | ||
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR | 62400-620 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0040 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0100 | ||
| Costar, 384-well plate | VWR | 29444-078 | ||
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
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