Nous fournissons un protocole détaillé pour la préparation de cellules primaires dissociées de<em> Drosophil</em> Un embryon. La capacité à mener à bien la perturbation effective ARNi, avec d'autres méthodes d'imagerie moléculaire, biochimique et cellulaire permettra une variété de questions qui seront abordées dans les<em> Drosophile</em> Cellules primaires.
Abstract
Nous décrivons ici une méthode de préparation et de la culture de cellules primaires dissociées à partir d'embryons de drosophile gastrula. En bref, une grande quantité d'embryons mis en scène des mouches jeunes et sains sont collectées, stérilisée, puis physiquement dissocié en une suspension cellulaire unique à l'aide d'un homogénéiseur de verre. Après avoir été plaqué sur des plaques de culture ou des diapositives de chambre à une densité appropriée dans le milieu de culture, ces cellules peuvent se différencier en d'autres de plusieurs types de cellules morphologiquement distinctes et qui peuvent être identifiés par leurs marqueurs cellulaires spécifiques. Par ailleurs, nous présentons les conditions pour le traitement de ces cellules avec double brin (ds) ARN pour susciter inactivation génique. Efficace ARNi dans les cellules de drosophile primaire est accomplie par la simple baignant les cellules dans un milieu de culture contenant ARNdb. La capacité de mener efficacement une perturbation ARNi, avec d'autres moléculaire, analyses biochimiques, d'imagerie cellulaire, permettra une variété de questions à répondre dans les cellules de drosophile primaire, en particulier ceux liés à la musculaires différenciées et des cellules neuronales.
Protocol
1. Préparation des cages volée Cultivez la drosophile (souches sauvages tels que l'Oregon-R ou tout autre génotype) dans des contenants pratiques tels que des tasses d'insectes 32-oz Transfert mouches nouvellement eclosed à de grandes cages d'embryon de collecte ou de voler des cages de la population. Déplacer les cages dans une pièce avec une température de ~ 25 ° C et une humidité ~ 65% dans une lumière de 12 h et une noire de 12 h du cycle afin de facilite…
Discussion
Le schéma de développement des cultures primaires de cellules de drosophile peut varier considérablement, probablement due à des variables de plusieurs cours du processus de préparation de cellules primaires. Tout d'abord, les mouches utilisées pour la ponte doivent être jeunes (dans une semaine) et saine (exempte d'infection virale ou bactérienne). Embryons non fécondés ou infectés doivent être évités, car ils sont inutiles et des cellules dérivées de ces embryons ne peuvent pas se diff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB a été soutenue par la Damon Runyon Cancer Research Fellowship Foundation DRG-1716-1702. JZ a été soutenu par le NIH / NIGMS Bourse F32 GM082174-02. NP est un enquêteur de l'Institut médical Howard Hughes.