אנו מספקים פרוטוקול מפורט להכנת תאים ראשוניים ניתק מן<em> Drosophil</em> עוברים. היכולת לבצע את ההפרעות יעיל RNAi, יחד עם אחרים שיטות הדמיה מולקולרית, ביוכימיות תא תאפשר מגוון של שאלות להתייחס אליה<em> תסיסנית</em> תאים ראשוניים.
Abstract
כאן אנו מתארים שיטה להכנת ותאי culturing העיקרי ניתק מעוברים תסיסנית gastrula. בקיצור, כמות גדולה של עוברי מבוים מפני זבובים צעירים ובריאים נאספים, מעוקר, ולאחר מכן ניתק פיזית לתוך ההשעיה תא בודד באמצעות homogenizer זכוכית. לאחר מצופה על צלחות תרבות או שקופיות קאמרית בצפיפות המתאים בינוני תרבות, תאים אלה יכולים להתמיין עוד כמה סוגי תאים מורפולוגית-ברורים, אשר ניתן לזהות על ידי סמנים ספציפיים שלהם התא. יתר על כן, אנו מציגים תנאים לטיפול תאים אלה עם גדילי כפול (DS) RNAs לעורר מציאה גן. RNAi יעיל בתאים תסיסנית העיקרית נעשית פשוט על ידי רחצה התאים בינוני dsRNA המכילים תרבות. היכולת לבצע יעיל ההפרעות RNAi, יחד עם אחרים מולקולרית, מנתח ביוכימיים הדמיה התא, יאפשר מגוון של השאלות ייענו בתאים תסיסנית העיקרי, במיוחד אלה הקשורים שריר מבודל תאים עצביים.
Protocol
1. הכנת כלובים לעוף לגדול תסיסנית (wild-type זנים כגון אורגון-R או כל גנוטיפ) במיכלים נוח כמו 32 גרם כוסות חרקים. העברת זבובים eclosed החדש לעובר איסוף כלובים גדולים או לטוס כלובים האוכלוסייה. <l…
Discussion
דפוס התפתחותי של תרבויות העיקרי של תאים תסיסנית יכול להשתנות במידה רבה, ככל הנראה בשל מספר משתנים במהלך תהליך התא הראשוני הכנה. קודם כל, זבובים המשמשים להנחת ביצה צריך להיות צעיר (בתוך שבוע הישן) ובריא (ללא זיהום נגיפי או חיידקי). עוברים מופרית או נגוע יש להימנע, ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB נתמכה על ידי דיימון רניון Cancer Research Foundation אחוות DRG-1716-1702. JZ נתמך על ידי NIH / NIGMS אחוות GM082174 F32-02. NP הוא חוקר של הווארד יוז רפואי במכון.