Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

Summary

Anopheles stephensi Mücken sind Vektoren für Malaria bewohnen Indien und ganz Asien. Dieses Video zeigt die Technik für die Durchführung microinjections dieser Art mit Transgene, dass Widerstand gegen die Malaria, die Mücke wird zu verleihen. Ein großer Teil der Methodik in diesem Video gezeigt, ist für die Mikroinjektion Techniken anderer Mückenarten.

Abstract

Die Einführung von exogenen Genen in den Genomen von Moskitos erfordert Mikroinjektion Techniken abgestimmt auf die spezifischen Arten von Interesse. Dieses Video-Protokoll beschreibt eine Methode durch die James-Labor verwendet werden, um DNA-Konstrukte in Anopheles stephensi Embryonen für die Erzeugung von transformierten Mücken microinject. Techniken für die Herstellung Mikroinjektion Nadeln, Sammlung und Aufbereitung von Embryonen und die Durchführung der Mikroinjektion dargestellt.

Protocol

Vorbereitung im Vorfeld der Mikroinjektion: Blut ernähren Mücken: für die Injektion von Montag bis Mittwoch Feed Weibchen auf der vorigen Freitag. Um Donnerstag und Freitag, Futtermittel Frauen am Montag injizieren der gleichen Woche. Bereiten Sie den Quartz Nadeln mit dem Programm 2 und isotonischen Puffer (siehe Materialien). "Legen tube" für die Embryonen ist die regelmäßige Drosophila Kultur Durchstechflasche. Wet Watte in den Boden, mit einem na…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Injection Quartz needles		Sutter Instrument		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Quiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification