Se describe un método para visualizar repetidamente microglia murina y los monocitos circulantes<em> In vivo</em> Más de horas, días o semanas con transcraneal microscopia de dos fotones. Demostramos cómo preparar una ventana adelgazado-cráneo que permite la observación de la microglía en reposo intermitente que puede ser activada por inyección estereotáxica adyacentes del Tat del VIH-1 proteína reguladora.
Tradicionalmente, en la neurociencia, en vivo imágenes de dos fotones de la murino sistema nervioso central o bien implicó el uso de 1,2 abierto el cráneo o calavera adelgazado tres preparaciones. Mientras que la técnica del cráneo abierto es muy versátil, no es el óptimo para el estudio de la microglía, ya que es invasivo y puede causar la activación de la microglia. Aunque el enfoque adelgazado-cráneo es mínimamente invasiva, los repetidos re-adelgazamiento de cráneo requiere para obtener imágenes de crónica aumenta el riesgo de lesión de los tejidos y la activación de la microglia y permite un número limitado de sesiones de la imagen. Aquí les presentamos una crónica delgada del cráneo método de la ventana de control microglia murina in vivo durante un período prolongado de tiempo, usando la microscopía de dos fotones. Demostramos cómo preparar una estable y accesible, adelgazada-cráneo ventana cortical (TSCW) con un cubreobjetos se ponga de lo que queda transparente a lo largo de tres semanas de observación intermitente. Esta preparación es mucho más TSCW inmunológicamente inerte con respecto a la activación de la microglia que craneotomía abierta o el cráneo repetidas adelgazamiento y permite un número arbitrario de sesiones de imágenes durante un período de semanas. Preparamos TSCW en CX 3 CR1 GFP / + ratones de 4 a visualizar microglia con aumento de proteína verde fluorescente para ≤ 150 m bajo la superficie pial. También mostramos que esta preparación se puede utilizar en combinación con inyecciones cerebrales estereotáctica de la proteína Tat del VIH-1 neurotóxicos, al lado del TSCW, que es capaz de inducir microgliosis duradero. Por lo tanto, este método es muy útil para examinar los cambios en la morfología y motilidad de la microglia en el tiempo en el cerebro que viven en los modelos de trastorno neurocognitivo asociado VIH (mano) y otras enfermedades neurodegenerativas con un componente neuroinflamatorios.
Existe un creciente consenso de que el sustrato real para el VIH-1 déficits neurocognitivos asociados (mano) es la destrucción de la arquitectura sináptica, presumiblemente causada por mediadores pro-inflamatorios liberados por el VIH-1 fagocitos mononucleares infectadas. Activación de la microglia, células gigantes multinucleadas, y gliosis debido a la hipertrofia astrocíticos se consideran características no específicas del VIH-1 infección y la inflamación en el sistema nervioso central 7. Por el contrario, la gravedad de la pre-mortem, la enfermedad neurológica se ha relacionado con pérdida de la complejidad sináptica, así como la carga de macrófagos en el sistema nervioso central 8,9,10,11. Sin embargo, la interacción dinámica entre la microglía, periféricos macrófagos infiltrantes, y de las neuronas en pacientes con la mano, simplemente no puede ser modelado utilizando procesos convencionales estáticos obtenidos de estudios convencionales de inmunohistoquímica. Estudios recientes de nuestro laboratorio han sugerido que al menos algunas de estas interacciones entre las células mononucleares periféricas y centrales y de las neuronas puede ser modelada en parte por la inyección estereotáxica de la epidemia del VIH-1 proteína Tat 1-72 en el parénquima cerebral (Lu, Marker, Tremblay, Qi, y Gelbard, datos no publicados). Por lo tanto, decidió aplicar en vivo imágenes de dos fotones para examinar la interacción entre los macrófagos derivados de monocitos, microglia residente del cerebro y las neuronas, en un modelo animal manejable pequeño para neuroSIDA. Mientras que las preparaciones abierta de cráneo o adelgazado cráneo-pagar un único examen de la arquitectura cortical por un breve período de tiempo (horas), los investigadores interesados en el curso temporal de los eventos subaguda no puede utilizar estos preparados sin artefacto activar microglia / macrófagos debido a la manipulación quirúrgica de la ventana de la bóveda craneal. Aquí se demuestra de una manera simple de evitar estas limitaciones, pegando un pequeño trozo de cubreobjetos de cristal sobre el área del cráneo adelgazado la prevención de la bóveda craneal de la regeneración en el TSCW, así como el mantenimiento de la translucidez de ≥ 3 semanas. Además, demuestran que esta técnica nos permite monitorear el comportamiento de los monocitos periféricos de entrar en la microvasculatura cerebral, así como la microglía del cerebro reside en respuesta a la inyección estereotáxica de VIH Tat 1-72 en la corteza de ratones heterocigotos para CX 3 CR 1 / GFP ( para identificar las células mononucleares de linaje). Esta técnica se puede adaptar fácilmente para su uso en ratones con diferentes fondos genéticos, por ejemplo, nosotros usamos heterocigotos CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 ratones para investigar las interacciones entre los derivados de los monocitos macrófagos, microglia residente cerebro y las neuronas en en modelos in vivo de la neuroinflamación relevantes a mano. Nuestra preparación TSCW permite a los investigadores para estudiar interacciones célula-célula entre la periferia y sistema nervioso central que pueden ocurrir en períodos de semanas, en la que puede ser el animal repetidamente la imagen antes y después del tratamiento experimental. Por lo tanto, cada animal puede servir como su propio control. Una advertencia para este modelo TSCW es que las células diana objeto de la investigación deben ser modificados genéticamente para expresar mejor las proteínas fluorescentes (eXFP) o tener una etiqueta con un tinte fluorescente, sin violación mecánica de la bóveda craneal, y que la expresión eXFP debe ser lo suficientemente robusta como para permitir que la arquitectura celular que se visualizan después de las sesiones de imágenes repetidas durante un período de semanas.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a Emily A. Kelly para el diseño de la placa con la cabeza.
Estamos muy agradecidos por el apoyo de premios NIH a HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 y el generoso apoyo del Fondo de Geoffrey Waasdorp Neurología Pediátrica, sin la cual este trabajo no habría sido posible. AKM es financiado por el NIH (EY019277), la Fundación de Whitehall, la Alfred P. Sloan Foundation y un premio de su carrera en las ciencias biomédicas del Fondo Burroughs Wellcome. MET es financiado por una Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Premio formación postdoctoral. DFM es un aprendiz en el Programa Científico de formación de médicos, financiado por el NIH T32 GM07356 y AI049815 T32.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |