Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden Monozyten<em> In vivo</em> Über Stunden, Tage oder Wochen mit der transkraniellen Zwei-Photonen-Mikroskopie. Wir zeigen, wie zu einem ausgedünnten-Schädel-Fenster, dass eine intermittierende Beobachtung der ruhenden Mikrogliazellen, die durch benachbarte stereotaktische Injektion der HIV-1 regulatorischen Proteins Tat aktiviert werden können, ermöglicht vorzubereiten.
Traditionell in den Neurowissenschaften, in vivo Zwei-Photonen-Imaging des murinen zentrale Nervensystem hat entweder den Einsatz von Open-Schädel 1,2 oder ausgedünnte Schädel 3 Vorbereitungen beteiligt. Während die Open-Schädel-Technik ist sehr vielseitig, es ist nicht für das Studium Mikroglia optimal, weil sie invasiv ist und Mikroglia-Aktivierung verursachen. Auch wenn die ausgedünnten Schädel Ansatz ist minimal-invasiv, das wiederholte erneut Ausdünnung des Schädels für chronische Bildgebung erforderlich erhöht das Risiko von Gewebeschäden und Mikroglia-Aktivierung und ermöglicht eine begrenzte Anzahl von Imaging-Sitzungen. Hier präsentieren wir eine chronische Dünn-Schädel-Fenster-Methode für die Überwachung murine Mikroglia in vivo über einen längeren Zeitraum hinweg mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Wir zeigen, wie man eine stabile, leicht zugängliche, ausgedünnte Schädel kortikale Fenster (TSCW) mit einem apposed Deckglas, dass transluzente im Laufe der drei Wochen intermittierende Beobachtung bleibt vorzubereiten. Diese TSCW Vorbereitung ist weit mehr immunologisch inert gegenüber Mikroglia-Aktivierung als offene Kraniotomie oder wiederholte Schädel Durchforstung und ermöglicht eine beliebige Anzahl von Imaging-Sitzungen während eines Zeitraums von Wochen. Wir bereiten TSCW in CX 3 CR 1 GFP / + Mäusen 4 bis Mikroglia mit Enhanced Green Fluorescent Protein auf ≤ 150 mu m unterhalb der Pia Oberfläche sichtbar zu machen. Wir zeigen auch, dass dieses Präparat in Verbindung mit stereotaktischen Hirn-Injektionen des HIV-1 neurotoxischen Protein Tat, neben dem TSCW, die zu induzieren vermag haltbare microgliosis ist, kann verwendet werden. Daher ist diese Methode sehr nützlich für die Prüfung Änderungen in Mikroglia-Morphologie und Motilität im Laufe der Zeit im lebenden Gehirn in Modelle der HIV-assoziierten neurokognitiven Disorder (HAND) und andere neurodegenerative Erkrankungen mit einem neuroinflammatorische Komponente.
Es besteht wachsender Konsens, dass das eigentliche Substrat für die HIV-1 assoziiert neurokognitiven Defizite (HAND) die Vernichtung der synaptischen Architektur, vermutlich von pro-inflammatorischen Mediatoren aus HIV-1 infizierten mononukleären Phagozyten freigesetzt verursacht wird. Mikroglia-Aktivierung, mehrkernige Riesenzellen und Gliose aufgrund astrozytären Hypertrophie gelten als unspezifische Markenzeichen des HIV-1 Infektion und Entzündung im ZNS 7. Im Gegensatz dazu hat die Schwere der premortem neurologische Erkrankung mit Verlust der synaptischen Komplexität sowie Makrophagen Belastung im ZNS 8,9,10,11 korreliert. Allerdings dynamischen Wechselwirkungen zwischen Mikroglia, periphere infiltrierenden Makrophagen und Neuronen bei Patienten mit HAND kann einfach nicht modelliert mit herkömmlichen statischen Verarbeitung von konventionellen immunzytochemische Studien gewonnen werden. Jüngste Studien aus unseren Labors haben ergeben, dass zumindest einige dieser Wechselwirkungen zwischen peripheren und zentralen mononukleären Zellen und Neuronen in Teil kann durch stereotaktische Injektion des HIV-1-Protein Tat 1-72 werden in Hirnparenchym (Lu, Marker, Tremblay modelliert, Qi und Gelbard, unveröffentlichte Daten). Wir beschlossen daher, in vivo Zwei-Photonen-Imaging gelten für das Zusammenspiel von Monozyten abgeleiteten Makrophagen, im Gehirn ansässigen Mikroglia und Neuronen zu untersuchen, in einem kleinen gefügig Tiermodell für NeuroAIDS. Während offenen Schädel oder ausgedünnte Schädel Vorbereitungen leisten einer einzigen Untersuchung der kortikalen Architektur für eine kurze Zeit (Stunden), Ermittler in den zeitlichen Verlauf der subakuten Ereignisse können nicht diese Präparate ohne artifactually Aktivierung Mikroglia / Makrophagen durch chirurgische Manipulation der interessierten die Schädeldecken Fenster. Hier zeigen wir eine einfache Möglichkeit zur Umgehung dieser Beschränkung durch Verkleben ein winziges Stück Deckglas über dem Schädel gelichtet Bereich verhindert das Schädeldach aus nachwachsenden in der TSCW sowie die Aufrechterhaltung Transluzenz für ≥ 3 Wochen. Wir zeigen ferner, dass uns diese Technik, um das Verhalten der peripheren Monozyten Eingabe zerebralen Mikrovaskulatur sowie Gehirn-Wohnsitz Mikroglia in Reaktion auf die stereotaktische Injektion von HIV-Tat 1-72 im Kortex von Mäusen, die heterozygot für CX 3 CR 1 / GFP überwachen kann ( zu identifizieren Zellen der mononukleären Linie). Diese Technik kann leicht angepasst, um auf Mäuse mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen verwenden, zum Beispiel verwenden wir routinemäßig heterozygot CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 Mäusen zu Wechselwirkungen zwischen Monozyten-Makrophagen, im Gehirn ansässigen Mikroglia und Neuronen in Untersuchung in vivo Modelle Neuroinflammation relevanten HAND. Unsere TSCW Vorbereitung ermöglicht Ermittler Zell-Zell-Interaktionen zwischen Peripherie und ZNS, die über Zeiträume von Wochen, in denen das Tier immer wieder vor und nach der experimentellen Behandlung abgebildet werden können auftreten zu studieren. So kann jedes Tier als seine eigene Kontrolle dienen. Eine Einschränkung für diese TSCW Modells ist, dass die Zielzellen untersucht werden entweder gentechnisch verändert, um verbesserte fluoreszierende Proteine (eXFP) ausdrückliche oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff ohne mechanische Verletzung der Schädelkalotte gekennzeichnet werden müssen, und dass eXFP Ausdruck muss robust genug sein, um ermöglichen zellulären Architektur zu werden, nachdem wiederholt Imaging-Sitzungen über einen Zeitraum von Wochen visualisiert.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei Emily A. Kelly für den Kopf-Bauweise.
Wir sind dankbar für die Unterstützung des NIH Auszeichnungen an HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 und die großzügige Unterstützung der Geoffrey Waasdorp Neuropädiatrie Fund, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. AKM wird durch die NIH (EY019277), Whitehall-Stiftung, der Alfred P. Sloan Foundation und ein Career Award in der Biomedizin von der Burroughs Wellcome Fund finanziert. MET wird von einem Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Postdoc-Preis finanziert. DFM ist ein Auszubildender im Medical Scientist Training Program, durch NIH T32 und T32 GM07356 AI049815 finanziert.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |