우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을 설명<em> 생체내에</em> 시간, 일 또는 transcranial 두 광자 현미경을 사용하여 주 동안. 우리는 HIV – 1 단백질 규제 태트의 인접한 stereotactic 분사에 의해 활성화될 수있는 정지 microglia의 간헐적인 관찰을 허용 thinned – 해골 창을 준비하는 방법을 보여줍니다.
전통적으로 신경 과학에서 생체내에 murine 중추 신경계의 두 광자 영상도 오픈 두개골 1,2 또는 thinned – 두개골 3 준비의 사용을 참여했다. 오픈 두개골 기술은 다용도로 쓰인다하는 동안 그것이 침략하고 microglial 활성화를 일으킬 수 있기 때문에, 그것은 microglia 공부를위한 최적되지 않습니다. thinned – 두개골 접근 법으로서에도 불구하고, 만성 이미징에 필요한 두개골 다시 밝은 반복하면 조직 손상과 microglial 활성화의 위험을 증가 및 이미징 세션의 제한된 수의를 허용합니다. 여기서 우리는 두 광자 현미경을 사용하여 오랜 시간 동안 생체내에 murine microglia을 감시하는 만성 박막 해골 창 방법을 제시한다. 우리는 간헐적인 관찰의 세 주 과정을 통해 투명 남아 apposed 유리 coverslip와 안정, 접근, thinned – 두개골 대뇌 피질의 창 (TSCW)를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 TSCW 준비가 훨씬 더 immunologically 불활성 숱이 오픈 craniotomy 또는 반복 두개골보다 microglial 활성화와 관련되고 주 기간 동안 이미징 세션의 임의의 숫자 수 있습니다. 우리는 pial 표면 아래 ≤ 150 μm의 향상된 녹색 형광 단백질과 microglia을 시각화하는 CX 3 CR 1 GFP / + 생쥐 4 TSCW을 준비합니다. 우리는 또한 이러한 준비가 내구성이 microgliosis을 유도하는 능력이 TSCW에 인접 태트 HIV – 1 neurotoxic 단백질의 stereotactic 뇌 주사와 함께 사용할 수 보여줍니다. 따라서,이 방법은 HIV 관련 Neurocognitive 장애 (수동)과 neuroinflammatory 구성 요소와 다른 neurodegenerative 질병 모델로 살아있는 두뇌에 시간이 지남에 따라 microglial 형태학 및 운동성 변화를 조사를 위해 매우 유용합니다.
HIV – 1 관련 neurocognitive의 결손 (수동)에 대한 실제 기판은 아마도 HIV – 1 감염 mononuclear phagocytes에서 출시된 프로 염증 중재자에 의한 시냅스 아키텍처의 파괴는 것을 강력히 주장하고있다. Microglial 활성화, multinucleated 거대한 세포, 그리고 astrocytic 비대로 인한 gliosis은 CNS 7 HIV – 1 감염과 염증의 특이 현상이 특징으로 간주됩니다. 반면, premortem neurologic 질환의 심각도는 시냅스 복잡 손실뿐만 아니라 CNS 8,9,10,11에서 대식 세포의 부담과 상관되었습니다. 그러나, microglia, 주변 침투 macrophages, 그리고 손으로 환자의 뉴런 사이의 역동적인 상호 작용은 단순히 기존의 immunocytochemical 연구에서 얻은 종래의 고정 처리를 사용하여 모델 수 없습니다. 우리 연구소의 최근 연구 주변 및 중앙 mononuclear 세포와 뉴런 사이의 이러한 상호 작용의 적어도 일부가 뇌 실질 조직 (류, 마커, 트렘블리로 HIV – 1 단백질 태트 1-72의 stereotactic 주사로 부분 모델 수있는 것을 제안했습니다 치, 그리고 Gelbard, 발표되지 않은 데이터). 따라서 neuroAIDS에 대해 다루기 쉬운 작은 동물 모델에서 단핵구 파생 macrophages, 뇌 주민 microglia과 뉴런 사이의 상호 작용을 검토하는 생체내 두 광자 이미징에 적용하기로 결정했다. 오픈 두개골 또는 thinned – 두개골 준비 시간이 짧은 기간 (시간)에 대한 대뇌 피질의 건축의 단일 심사, artifactually 인해의 수술 조작에 microglia / 대식 세포를 활성화하지 않고 이러한 준비를 사용할 수 없습니다 아급성 이벤트의 시간 코스에 관심이 조사 여유가 있지만 calvarial 창. 여기 gluing TSCW의 재생에서 두개관을 방지뿐만 아니라 ≥ 3 주간 반투명을 유지 thinned 두개골 영역 유리 coverslip의 작은 조각하여 이러한 한계를 우회의 간단한 방법을 보여줍니다. 우리는 더이 기술이 우리 (CX 3 CR 1 / GFP에 대한 heterozygous 생쥐의 피질에있는 HIV 태트 1-72의 stereotactic 분사에 대한 응답으로 뇌성 microvasculature뿐만 아니라 두뇌 주자 microglia를 입력 주변 monocytes의 행동을 관찰 할 수 있습니다는 것을 보여준다 mononuclear 혈통의 세포를 식별). 이 기술은 쉽게 다른 유전 배경을 가진 생쥐를 사용하여 적용할 수 있습니다, 예를 들어, 우리는 정기적으로 heterozygous CX 3 CR 1 / GFP를 사용하여 X 뜻 – 1 단핵구 파생 macrophages, 뇌 주민 microglia 및 뉴런 간의 상호 작용을 조사하기 위해 YFP 12 쥐 손에 관련 neuroinflammation의 생체내 모델 인치 우리 TSCW 준비는 조사관은 주변과 동물 실험 반복 치료 전후에 몇 군데 수있는 주간의 기간, 이상 발생할 수 있습니다 CNS 사이 세포 세포의 상호 작용을 공부하실 수 있습니다. 따라서, 각 동물 자체 제어로 검색할 수 있습니다. 이 TSCW 모델에 대한 하나 주의해야 할 점은 조사에서 대상 세포 중 유전자 향상된 형광 단백질 (eXFP)를 표현하거나 두개 관의 기계적 위반하지 않고 형광 염색이 표시 설계해야 할 것입니다, 그 eXFP 표현은 충분히 강력한해야합니다 셀룰러 아키텍처 주 기간 동안 반복 이미징 세션 이후 시각 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 머리 플레이트 디자인 에밀리 A. 켈리 감사합니다.
우리는 노파에게 NIH 보너스의 지원에 대한 감사 : PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851이 작업이 가능 않았을 텐데 어떤 않고 제프리 Waasdorp 소아 신경과의 기금의 관대한 지원합니다. AKM은 NIH (EY019277), 화이트홀 재단, 알프레드 P. 슬로안 재단과 버로우즈 웰컴 기금에서 의생명 과학의 경력 수상으로 후원됩니다. MET는 퐁 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ) 박사 교육 수상에 의해 후원됩니다. DFM은 NIH T32 GM07356 및 T32 AI049815에 의해 재정 지원 의료 과학자 훈련 프로그램에 연수생입니다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |