Descriviamo un metodo per la visualizzazione ripetutamente microglia murina e monociti circolanti<em> In vivo</em> Più di ore, giorni o settimane utilizzando transcranico microscopia a due fotoni. Dimostriamo come preparare un assottigliato-teschio finestra che permette l'osservazione intermittenti di microglia quiescenti che possono essere attivate mediante iniezione stereotassica adiacenti del virus HIV-1 proteina regolatrice Tat.
Tradizionalmente nel campo delle neuroscienze, l'imaging in vivo due fotoni del murino sistema nervoso centrale o ha comportato l'uso di open-cranio 1,2 o diluito cranio-3 preparati. Mentre la tecnica open-cranio è molto versatile, non è ottimale per lo studio microglia, perché è invasiva e può causare l'attivazione della microglia. Anche se il diradamento-cranio approccio mini-invasivo, le ripetute ri-assottigliamento del cranio necessari per l'imaging cronica aumenta il rischio di danno tissutale e attivazione della microglia e permette per un numero limitato di sessioni di imaging. Qui vi presentiamo una malattia cronica sottile cranio metodo della finestra per il monitoraggio microglia murini in vivo per un periodo prolungato di tempo utilizzando la microscopia a due fotoni. Dimostriamo come preparare una stalla, accessibile, assottigliato-cranio finestra corticale (TSCW) con un coprioggetto di vetro traslucido apposto che rimane nel corso di tre settimane di osservazione intermittente. Questa preparazione è molto più TSCW immunologicamente inerte rispetto alla attivazione della microglia di craniotomia aperti o cranio ripetuti assottigliamento e permette un numero arbitrario di sessioni di imaging durante un periodo di settimane. Prepariamo TSCW in CX 3 GFP CR 1 / 4 + mouse per visualizzare microglia con maggiore proteina fluorescente verde a ≤ 150 micron sotto la superficie piale. Mostriamo anche che questa preparazione può essere utilizzato in combinazione con iniezioni cerebrale stereotassica della proteina HIV-1 Tat neurotossici, adiacente al TSCW, che è in grado di indurre microgliosis durevole. Pertanto, questo metodo è molto utile per esaminare i cambiamenti nella morfologia e la motilità della microglia nel corso del tempo nel cervello che vivono in modelli di Disturbo da HIV Associated neurocognitive (mano) e di altre malattie neurodegenerative con una componente neuroinfiammatorie.
Vi è un consenso crescente che il substrato reale per l'HIV-1 deficit neurocognitivi associati (mano) è la distruzione di architettura sinaptica, presumibilmente causata da mediatori pro-infiammatori rilasciati da HIV-1 infetti fagociti mononucleari. Attivazione della microglia, cellule giganti multinucleate e gliosi a causa di ipertrofia degli astrociti sono considerate caratteristiche non specifiche di HIV-1 e l'infiammazione del sistema nervoso centrale 7. Al contrario, la gravità della malattia neurologica premortem è stata correlata con la perdita di complessità sinaptica, così come fardello dei macrofagi nel SNC 8,9,10,11. Tuttavia, le interazioni dinamiche tra microglia, macrofagi periferici infiltrazione, e neuroni nei pazienti con MANO semplicemente non possono essere modellati con i convenzionali di lavorazione statici ottenuti da studi convenzionali immunocitochimica. Recenti studi nei nostri laboratori hanno suggerito che almeno alcune di queste interazioni tra le cellule mononucleate periferiche e centrali e neuroni possono essere modellati in parte mediante iniezione stereotassica di HIV-1 proteina Tat 1-72 nel parenchima cerebrale (Lu, Marker, Tremblay, Qi, e Gelbard, dati non pubblicati). Abbiamo quindi deciso di applicare l'imaging in vivo due fotoni per esaminare l'interazione tra monociti-macrofagi derivati, residente microglia e neuroni del cervello, in un modello animale docile piccolo per neuroAIDS. Mentre aperto cranio o diluito-cranio preparati permettersi un singolo esame di architettura corticale per un breve periodo di tempo (in ore), i ricercatori interessati nel corso di tempo degli eventi subacuta non può usare queste preparazioni senza artifactually attivare microglia / macrofagi a causa della manipolazione chirurgica del la finestra cranica. Qui mostriamo un modo semplice per aggirare queste limitazioni incollando un piccolo pezzo di vetro coprioggetto sopra la zona cranio assottigliato prevenire la calotta cranica di rigenerarsi nel TSCW così come mantenere la trasparenza per ≥ 3 settimane. Abbiamo inoltre dimostrato che questa tecnica ci permette di monitorare il comportamento dei monociti periferici entrare microcircolo cerebrale e cervello residenti microglia in risposta a iniezione stereotassica di HIV Tat 1-72 nella corteccia di topi eterozigoti per CX 3 CR 1 / GFP ( per identificare le cellule mononucleate del lignaggio). Questa tecnica può essere facilmente adattato per l'uso su topi con diverso background genetico, ad esempio, si usano abitualmente eterozigoti CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 topi per indagare le interazioni tra le derivate da monociti macrofagi, microglia residente cervello e neuroni modelli in vivo di neuroinfiammazione rilevanti per MANO. La nostra preparazione TSCW consente agli investigatori di studiare interazioni cellula-cellula tra la periferia e sistema nervoso centrale che possono verificarsi in periodi di settimane, in cui l'animale può essere più volte ripreso, prima e dopo il trattamento sperimentale. Così, ogni animale può servire come proprio controllo. Un avvertimento per questo modello TSCW è che le cellule bersaglio sotto inchiesta devono essere geneticamente per esprimere una maggiore proteine fluorescenti (eXFP) o essere marcati con un colorante fluorescente senza violazione meccanica della calotta cranica, e che l'espressione eXFP devono essere sufficientemente robuste per permettono architettura cellulare da visualizzare dopo le sessioni di imaging ripetuti per un periodo di settimane.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Emily A. Kelly per la progettazione piastra testa.
Siamo grati per il sostegno di premi NIH di HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 e il generoso sostegno della Neurologia Pediatrica Geoffrey Waasdorp Fondo senza la quale questo lavoro non sarebbe stato possibile. AKM è finanziato dal NIH (EY019277), Whitehall Foundation, la Fondazione Alfred P. Sloan e un Premio alla Carriera nel Scienze Biomediche dalla Burroughs Wellcome Fondo. MET è finanziato da un Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) premio di formazione post-dottorato. DFM è un tirocinante nel Programma di formazione medica Scientist, finanziato dal NIH GM07356 T32 e T32 AI049815.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |