DNA estável-isótopo sondagem é um método de cultivo independente para identificar e caracterizar as comunidades ativa de microorganismos que são capazes de utilizar substratos específicos. Assimilação do substrato enriquecido em isótopo pesado leva a incorporação de átomos marcados em biomassa microbiana. Ultracentrifugação em gradiente de densidade recupera DNA marcado para jusante análises moleculares.
DNA estável-isótopo sondagem (DNA-SIP) é uma técnica poderosa para a identificação de microorganismos ativos que assimilar substratos de carbono especial e nutrientes em biomassa celular. Como tal, esta técnica de cultivo independente tem sido uma metodologia importante para a atribuição de função metabólica para as diversas comunidades que habitam uma grande variedade de ambientes terrestres e aquáticos. Após a incubação de uma amostra ambiental com isótopos estáveis compostos marcados, extraídos de ácido nucléico é submetido a ultracentrifugação de gradiente de densidade e fracionamento gradiente subseqüentes para separar ácidos nucléicos de densidades diferentes. Purificação de DNA a partir de cloreto de césio recupera rotulados e não rotulados DNA para a caracterização molecular posterior (por exemplo, impressões digitais, microarrays, bibliotecas clone, metagenomics). Este protocolo fornece vídeo JOVE visuais passo-a-passo explicações do protocolo para fracionamento de gradiente de densidade gradiente de ultracentrifugação, e recuperação de DNA rotulados. O protocolo também inclui dados de amostra SIP e destaca dicas importantes e cuidados que devem ser considerados para garantir uma análise de DNA SIP-sucedido.
Projeto adequado de isótopos estáveis experimentos sondagem é de importância crítica para a obtenção de DNA marcado acima da comunidade de fundo sem rótulo. Considerações sobre a amostra de tempos de incubação, as concentrações de substrato, condições de incubação (por exemplo, nutrientes, teor de umidade do solo), cross-alimentação e replicação têm sido discutidas em outros lugares 10,18 e recomendamos ao leitor consultar estas publicações quando se projeta um incubação SIP. …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Projeto Estratégico e Subsídios Descoberta a JDN das Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada (NSERC).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |