DNA stabilen Isotopen ist ein Anbau-unabhängige Methode zur Identifizierung und Charakterisierung aktiver Gemeinschaften von Mikroorganismen, die fähig werden bestimmte Substrate sind. Assimilation von Substrat in schweren Isotop angereichert führt zu Einbau von markierten Atome in mikrobielle Biomasse. Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ruft markierter DNA für nachgeschaltete molekulare Analysen.
DNA stabilen Isotopen (DNA-SIP) ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Identifizierung von aktiven Mikroorganismen, insbesondere Kohlenstoff-Substraten und Nährstoffe in zelluläre Biomasse zu assimilieren. Als solcher hat dieser Anbau-unabhängige Technik eine wichtige Methodik für die Vergabe metabolische Funktion, um die verschiedenen Gemeinschaften bewohnen eine Vielzahl von terrestrischen und aquatischen Umgebungen. Nach der Inkubation eines Umwelt-Probe mit stabilen Isotopen markierten Verbindungen, extrahiert Nukleinsäure Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und die anschließende Steigung Fraktionierung unterzogen, um Nukleinsäuren unterschiedlicher Dichte zu trennen. Reinigung von DNA aus Cäsiumchlorid ruft beschriftet und unbeschriftet DNA für die anschließende molekulare Charakterisierung (z. B. Fingerabdrücke, Microarrays, Klon-Bibliotheken, Metagenomik). Diese JoVE Video-Protokoll bietet visuelle Schritt-für-Schritt-Erklärungen für das Protokoll für die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, Gradienten Fraktionierung und Rückgewinnung von markierten DNA. Das Protokoll enthält außerdem Beispielcode SIP Daten und hebt wichtige Tipps und Hinweise, die zu berücksichtigen, um eine erfolgreiche DNA-SIP-Analyse zu gewährleisten.
Eine sachgerechte Konstruktion der stabilen Isotopen Experimente ist von entscheidender Bedeutung für den Erhalt von markierter DNA vor dem Hintergrund unbeschrifteten Gemeinschaft. Überlegungen im Zusammenhang mit Inkubationszeiten Substratkonzentrationen, Inkubationsbedingungen (z. B. Nährstoffe, Feuchtigkeitsgehalt des Bodens), Cross-Fütterung und Replikation Probe wurden an anderer Stelle 10,18 und diskutiert, empfehlen wir dem Leser wenden diese Veröffentlichungen bei der Gestaltung eines SIP Inkuba…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von Strategic Project and Discovery Zuschüsse an JDN aus dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) unterstützt.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |