DNA-stabiele isotoop sonderen is een teelt-onafhankelijke methode voor het identificeren en karakteriseren van actieve gemeenschappen van micro-organismen die in staat zijn gebruik te maken van specifieke substraten. Assimilatie van de ondergrond verrijkt met zware isotoop leidt tot opname van gelabelde atomen in de microbiële biomassa. Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie haalt gelabeld DNA voor de downstream-moleculaire analyses.
DNA-stabiele isotoop indringende (DNA-SIP) is een krachtige techniek voor het identificeren van actieve micro-organismen die bepaalde koolstofsubstraten en voedingsstoffen te assimileren in cellulaire biomassa. Als zodanig is deze teelt-onafhankelijke-techniek is een belangrijke methode voor het toewijzen van metabolische functie om de diverse gemeenschappen bewoont een breed scala van terrestrische en aquatische milieus. Na de incubatie van een milieu-monster met een stabiele isotoop-gelabelde stoffen, wordt gewonnen nucleïnezuur onderworpen aan dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en de daaropvolgende helling fractionering aan nucleïnezuren van verschillende dichtheden scheiden. Zuivering van DNA van cesium chloride ophaalt gelabeld en ongelabelde DNA voor verdere moleculaire karakterisering (bijvoorbeeld vingerafdrukken, microarrays, kloon bibliotheken, metagenomica). Deze video Jove protocol biedt visuele stap-voor-stap uitleg van het protocol voor de dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, gradiënt fractionering en herstel van gelabelde DNA. Het protocol bevat ook proeven van SIP-gegevens en belicht belangrijke tips en waarschuwingen die moeten worden beschouwd als een succesvolle DNA-SIP-analyse te garanderen.
Goed ontwerp van stabiele isotoop-probing experimenten is van cruciaal belang voor het verkrijgen van het label DNA boven de achtergrond ongelabelde gemeenschap. Overwegingen met betrekking tot incubatietijden, substraatconcentraties, incubatieomstandigheden (bv. voedingsstoffen, bodemvocht), cross-voeding en replicatie monster zijn elders 10,18 besproken en adviseren wij de lezer deze publicaties bij het ontwerpen van een SIP-incubatie. Gerelateerd aan de huidige protocol, is het de moeite waard commen…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door Strategic Project en Discovery Subsidies voor JDN van het Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |