Mikroinjektion von Drosophila Krankenschwesterzellen: Eine Methode der intrazellulären Verabreichung

Abstract

Quelle: Catrina, I. E., et al. Visualizing and Tracking Endogene mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. (2019).

Aufgrund ihrer großen Größe und relativ einfachen Organisation sind Drosophila Ammenzellen ideal für Live-Zell-Bildgebungsstudien geeignet. Dieses Video beschreibt eine Mikroinjektionsmethode für die Abgabe von exogenen Verbindungen in die Zellen, und das vorgestellte Protokoll zeigt das Verfahren mit fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden, sogenannten molekularen Baken (MBs), die zur Visualisierung endogenes mRNA-Transkripte verwendet werden.

Protocol

Dieses Protokoll ist aus Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogene mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019). 1. Design von MBs für Live Cell Imaging Falten Sie die Ziel-RNA-Sequenz, um die sekundäre Struktur des mRNA-Ziels mithilfe der “RNA-Form” vom mfold-Server (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-For…

Materials

Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing