Lentivirus 제작
Summary
lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi)은 살아있는 세포에서 유전자 입을의 시스템입니다. RNAi에 유전자가 상동 짧은 간섭 RNAS을 순서대로 (siRNA) 포스트 transcriptional 상태에서 침묵하고 있습니다. 짧은 헤어핀 RNAS, siRNA에 엽 성의 전구 물질은 세포 유형의 다양한 RNAi 수있게 lentivirus을 사용하여 표현할 수있다. 같은 인간 면역 결핍 바이러스로 Lentiviruses는, 세포를 분리 및 비 분리를 모두 감염을 수 있습니다. 우리는 어떤 패키지 lentiviruses에 절차를 설명합니다. 포장은 DNA 벡터에서 관할 바이러스의 준비를 말합니다. Lentiviral 벡터 생산 시스템은 자연의 바이러스 게놈은 개인 도우미 플라스미드 구조로 분할되어 '분할'시스템을 기반으로합니다. 네 별도의 벡터로 다른 바이러스 요소의 분할은 lentiviral 게놈의 우발적인 재조합에 의한 복제 가능 바이러스를 생성의 위험을 감소. 여기, 관심을 세 포장 벡터의 shRNA (P – VSVG, pRSV, pMDL)를 포함하는 벡터가 transiently 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 최소한 48 시간 잠복기 후, 바이러스가 포함된 뜨는은 수확과 집중되어 있습니다. 마지막으로, 바이러스 titer는 기자 (형광) 흐름 cytometer와 표현에 의해 결정됩니다.
Protocol
Acknowledgements
샌들러 천식 기초 연구 센터 (세이버)
샌들러 재단
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS | Invitrogen | |||
| FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche | |||
| Bleach | Clorox | |||
| 10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes | Falcon | 353003 | ||
| Multichannel pipette | Rainin | |||
| Filtered pipette tips | Rainin | |||
| 1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm) | Eppendorf | |||
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | |||
| Tissue culture incubator at 5% CO2 | Coulter | |||
| Beckman SW41T.I rotor | ||||
| Beckman ultracentrifuge | Beckman | |||
| Fluorescent microscope | Coulter | |||
| FACS Array | Beckman |
References
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. . J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
