لجعل lentiviruses ، هي ناقلات transfected الحمض النووي في الخلايا البشرية 293. بعد الحصاد ، وتركيز طاف ، يتم تحديد عيار الفيروس عن طريق التعبير مضان مع تدفق عداد الكريات.
Abstract
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هو نظام لإسكات الجينات في الخلايا الحية. في رني ، في تسلسل الجينات مثلي قصيرة الرناوات التدخل (سيرنا) يتم إسكاتها في دولة ما بعد النسخي. ويمكن التعبير عن الرناوات دبوس الشعر القصير ، والسلائف لسيرنا ، وذلك باستخدام الفيروسة البطيئة ، مما يسمح لرني في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. Lentiviruses ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية ، قادرة على اصابة كل من الانقسام وعدم تقسيم خلايا. سنقوم بشرح الإجراء الذي lentiviruses إلى الحزمة. التغليف يشير إلى إعداد الأكفاء من نواقل فيروس الحمض النووي. وتستند نظم الإنتاج Lentiviral ناقلات على نظام "تقسيم" ، حيث تم تقسيم الجينوم الفيروسي في البنى الطبيعية المساعد الفردية البلازميد. تقسيم هذه العناصر الفيروسية المختلفة إلى أربع ناقلات منفصلة يقلل من خطر خلق الفيروس قادر على تكرار إعادة التركيب من قبل العارض للجينوم lentiviral. هنا ، transfected عابر متجه تحتوي على shRNA من الاهتمام والتعبئة والتغليف ناقلات الثلاث (ف VSVG ، pRSV ، pMDL) في خلايا الإنسان 293. على الأقل بعد فترة حضانة لمدة 48 ساعة ، هو حصاد طاف الفيروس التي تحتوي على ومركزة. أخيرا ، يتم تحديد عيار الفيروس بواسطة مراسل (الفلورية) التعبير مع تدفق عداد الكريات.
Protocol
الجزء 1 : ترنسفكأيشن من الخلايا لإنتاج 293 كلوة الجنين البشري Lentiviruses * قبل 24 ساعة ترنسفكأيشن ، لوحة الخلايا 2.5 X 6 10 في صحن 10cm عن confluency من 50-70 ٪ في اليوم التالي. يبدأ هذا البروتوكول…
Acknowledgements
ساندلر الربو مركز البحوث الأساسية (SABRE) مؤسسة ساندلر