כדי להפוך את lentiviruses, וקטורים DNA הם transfected 293 לתוך תאים אנושיים. לאחר הקציר ריכוז supernatant, titer וירוס נקבעת על ידי ביטוי פלואורסצנציה עם cytometer זרימה.
Abstract
התערבות RNA (RNAi) היא מערכת של להשתקת גנים בתאים חיים. ב RNAi, גנים הומולוגיים ברצף RNAs התערבות קצרות (siRNA) מושתקים במצב שלאחר תעתיק. RNAs מכבנה קצר, מקדימים siRNA, ניתן לבטא באמצעות lentivirus, המאפשר RNAi במגוון רחב של סוגי תאים. Lentiviruses, כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי, הם מסוגלים להדביק גם חלוקת ולא חלוקת התאים. נתאר תהליך אשר עד lentiviruses החבילה. אריזות מתייחס הכנת וירוס המוסמכת וקטורים מ-DNA. Lentiviral ייצור מערכות וקטור מבוססים על מערכת "פיצול", כאשר הגנום הנגיפי טבעי כבר התפצלה בונה עוזר אישי פלסמיד. זה פיצול של אלמנטים ויראליים שונים לארבע וקטורים נפרד מפחית את הסיכון של יצירת שכפול נגיף המסוגל ידי רקומבינציה adventitious של הגנום lentiviral. כאן, וקטור המכיל את shRNA עניין ושלושה וקטורים אריזה (p-VSVG, pRSV, pMDL) הם transfected transiently לתוך 293 תאים אנושיים. לאחר תקופה לפחות 48 שעות דגירה, supernatant וירוס המכיל נאסף ומרוכז. לבסוף, titer וירוס נקבעת על ידי הכתב (ניאון) הביטוי cytometer זרימה.
Protocol
חלק 1: transfection של HEK 293 תאים כדי לייצר Lentiviruses * 24 שעות לפני, transfection צלחת 2.5 X 10 6 תאים צלחת 10 ס"מ עבור confluency של 50-70% למחרת. התחל בפרוטוקול זה על ידי הכנת ה-DNA עם איזה מהם יהיה מאוחר tra…