Это видео-статья описывает, шаг за шагом, как обрабатывать сперму для достижения хорошего качества флуоресценции<em> На месте</em> Гибридизации на человеческие сперматозоиды. Подготовка получены могут быть использованы для скрининга анеуплоидии в контексте клинического диагноза.
Abstract
Анеуплоидии являются наиболее частыми хромосомных аномалий у человека. Большинство из этих нарушений в результате ошибки во время мейоза gametogenic процесса в родителях. В человеческих самцов, эти ошибки могут привести к производству сперматозоидов с числовым хромосомных аномалий, которые представляют повышенный риск передачи этих аномалий в потомстве.
По этой причине методика флуоресценции в гибридизация (FISH) на ядрах сперматозоидов стал протокол широко включены в контексте клинического диагноза. Эта практика позволяет оценить частоты численных хромосомных аномалий в гаметах пациентов, которые ищут генетические репродуктивного совет.
На сегодняшний день хромосом наиболее часто включаются в анализ спермы рыб хромосом X, Y, 13, 18 и 21.
Это видео-статья описывает, шаг за шагом, как обрабатывать и исправлять человеческие образцы спермы, как decondense и денатурировать спермы хроматина, как действовать, чтобы получить сперму подготовка рыбы, и, как визуализировать результаты на микроскоп. Особые замечания из наиболее важных шагов даны для достижения наилучших результатов.
Protocol
И. обработки проб и фиксации клеток Оставьте спермы в стерильных контейнерах при комнатной температуре в течение 20 минут, пока сжижения. Передача образца центрифуги трубки и вращать его в 1000 г. в течение 5 минут. Аккуратно снимите и выбросьте супернатант помощью пипетки…
Discussion
Этот протокол описывает процесс человеческого образцы спермы для получения препаратов сперматозоидов FISH. Используя этот протокол, можно анализировать хромосомные аномалии в мужских гамет. Сперматозоиды анеуплоидии скрининга заявки либо в контексте фундаментальных исследований и в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Женералитата Каталонии (2005-SGR00437). Авторы выражают благодарность Дж. Бланко и Ф. Видаль для их контроля и поощрения, и Дж. Лукас за техническую помощь.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
1,4-Dithiothreitol (DTT)
Material
Roche
10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol
Material
Roche
10708976001
Acetic acid
Material
Merck
100.063
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
20xSaline-Sodium Citrate
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II)
CEP 18/X/Y DNA probe
NP-40
LSI 13/21 DNA probe
Material
Vysis Inc.
32-161075
30-805850
30-804941
30-171077
30-804820
30-171078
Centrifuge 5804R
Tool
Eppendorf
Centrifuge tube
Material
Nunc
347856
Coplin jar (glass)
Material
Barloworld Scientific
Hellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)
Material
Deltalab
191087
Cover slips (15×15)
Material
Knittel gläser
4600115
Cover slips (18×18)
Material
Knittel gläser
4600118
Diamond pencil
Material
Hammacher
335117010
Ethanol
Material
Merck
100.983
Formamide
Material
Roche
11814320001
Freezer
Tool
Zanussi
Gloves
Material
Sanyc
101/3300
HYBrite™
Tool
Vysis Inc.
Immersion Oil
Material
Olympus
35505
Incubator
Tool
Heraeus
Methanol
Material
Merck
106.009
Micropipette
Material
Labsystems
Finnpipette (4500000)
Micropipette replacement tip
Material
Daslab
16-2001
Nail varnish
Material
Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscope
Tool
Olympus
Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red.