פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם
Summary
זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, כיצד תהליך דגימת זרע כדי להשיג באיכות טובה פלואורסצנטי<em> באתרו</em> הכלאה על בזרע אנושי. ההכנות שהושגו ניתן להשתמש להקרנה aneuploidy בהקשר של אבחנה קלינית.
Abstract
Aneuploidies הם פגמים בכרומוזומים השכיח ביותר בבני אדם. רוב הפרעות אלו נובעות שגיאות meiotic בתהליך gametogenic אצל ההורים. אצל גברים אנושיים, שגיאות אלה יכולים להוביל לייצור של זרע עם הפרעות כרומוזום מספריים המייצגים סיכון מוגבר להעברת אנומליות אלה לצאצאים.
מסיבה זו, את הטכניקה של הקרינה הכלאה באתרו (FISH) על גרעין הזרע הפך פרוטוקול שולבו נרחב בהקשר של אבחנה קלינית. בפועל זה מספק אומדן של תדרים של הפרעות כרומוזום מספריים הגמטות של המטופלים המבקשים ייעוץ גנטי הרבייה.
עד כה, את הכרומוזומים כללו לרוב בניתוח FISH הזרע הם כרומוזומי X, Y, 13, 18 ו – 21.
זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, איך לעבד ולתקן דגימת זרע אנושי, איך decondense ו לפגל הכרומטין זרע, כיצד להמשיך לקבל ההכנות FISH הזרע, וכיצד לחזות את התוצאות במיקרוסקופ. הערות מיוחדות הצעדים המשמעותיים ביותר ניתנים על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך דגימות זרע אנושי להשגת FISH ההכנות הזרע. באמצעות פרוטוקול זה ניתן לנתח פגמים בכרומוזומים של גמטות זכריות. ההקרנה זרע aneuploidy יש יישומים גם בהקשר של מחקר בסיסי בייעוץ הרבייה שניתנה זכרים עקרים. למרות האבחנה הקלינית הכרומוזומים ביותר למד נרחב ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Generalitat דה קטלוניה (2005-SGR00437). המחברים מודים ל י פ ו בלאנקו וידאל לפיקוח שלהם עידוד, ג'לוקאס לקבלת סיוע טכני שלו.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
|
Material | Vysis Inc. | 32-161075
|
|
| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nunc | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15×15) | Material | Knittel gläser | 4600115 | |
| Cover slips (18×18) | Material | Knittel gläser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyc | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus | ||
| Methanol | Material | Merck | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Diaphot | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel gläser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B/Braun | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
