この手順では、マウス骨髄からプライマリ造血細胞培養を確立し、ジーンパルサーMXCellのエレクトロポレーションシステムを用いてトランスフェクションが続いている方法について説明します。
それは、エレクトロポレーションは、プライマリ細胞にプラスミドDNAやsiRNAを導入するための最も効果的な方法であることがますます明らかになってきている。ジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムとジーンパルサーのエレクトロポレーションバッファー特に哺乳動物細胞や、プライマリおよび幹cells.Thisビデオなどの困難なトランスフェクション細胞に核酸をトランスフェクトするために開発されたマウス骨髄からプライマリ造血細胞培養を確立する方法を示していますし、MXcellシステムにおけるエレクトロポレーションのためにそれらを準備する。我々は、大腿骨と脛骨を分離することから始めます。大腿骨と脛骨の両方から骨髄を回収され、文化が確立されています。培養骨髄細胞は、トランスフェクションと分析される。
より多くのゲノム情報が出てくるとこのようなsiRNAなどの新しいツールが開発されるように、生理学的に関連する細胞の使用は、病気の経路、タンパク質 – タンパク質相互作用、及びシグナル伝達の理解を促進するためにこれまで以上に重要になっています。初代細胞は、組織又は体液から直接取得し、in vitroで栽培されている。これらの細胞は、外因性遺伝物質の導入などを通じて、さまざまな方法で操作することができます。それは一次細胞にプラスミドDNAやsiRNAを導入する最も効果的な方法は、エレクトロポレーションであることがますます明らかになってきている。
エレクトロポレーションは、一時的にそれによって外因性核酸は、細胞を入力できるように、細胞膜の透過性を向上させるために電気パルスにセルを公開します。トランスフェクションのこのメソッドは、異なる細胞タイプ/ラインと、このように、マスト細胞をトランスフェクトするために使用できるだけでなく、他の骨髄由来細胞の違いに対応するために最適化することができます。さらに、ウイルスの媒介トランスフェクションとは異なり、エレクトロポレーションはトランスフェクトしたDNAのサイズに制限があります、また大規模な準備を必要としません。脂質媒介トランスフェクションとは対照的に、エレクトロポレーションは、毒性の低いことができ、トランスフェクトされた核酸のエンドソーム捕捉されることはありません。
バイオラッドは、これらの細胞のために特別にMXcellのエレクトロポレーションシステムを開発しました。 MXcellは、あなたのトランスフェクション効率と細胞生存率を最大化するための条件を変化させることができます。トランスフェクション効率を最適化し、細胞死を最小限にするためには、電圧、キャパシタンス、抵抗、およびパルス長を含むエレクトロポレーションパラメータの多数を調整し、評価することができます。