Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.
Het wordt steeds duidelijker dat elektroporatie is de meest effectieve manier om plasmide DNA of siRNA introduceren in primaire cellen. De Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem en Gene Puiser elektroporatie buffer zijn speciaal ontwikkeld om nucleïnezuren te transfecteren in zoogdiercellen en moeilijk te transfecteren cellen, zoals de primaire en stam cells.This video laat zien hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf muizen beenmerg , en vervolgens hen voor te bereiden elektroporatie in het MXcell systeem. We beginnen met het isoleren van dijbeen en scheenbeen. Beenmerg van zowel de femur en de tibia worden dan geoogst en culturen zijn gevestigd. Gekweekte beenmergcellen worden vervolgens getransfecteerd en geanalyseerd.
Naarmate meer genomische informatie naar voren komt en nieuwe tools zoals siRNA worden ontwikkeld, is het gebruik van fysiologisch relevante cellen worden steeds belangrijker voor ons begrip van de ziekte wegen, eiwit-eiwit interacties, en signaaltransductie verder. Primaire cellen worden rechtstreeks verkregen uit weefsels of vloeistoffen en gekweekt in vitro. Deze cellen kunnen worden gemanipuleerd in een aantal manieren, onder meer door de introductie van exogeen genetisch materiaal. Het wordt steeds duidelijker dat de meest effectieve manier om plasmide DNA of siRNA te introduceren in primaire cellen is elektroporatie.
Elektroporatie blootstelt cellen elektrische pulsen om tijdelijk verhoging van de permeabiliteit van de celmembraan, waardoor exogene nucleïnezuren naar de cel in te voeren. Deze methode van transfectie kunnen worden geoptimaliseerd om ruimte maken voor verschillen tussen de verschillende celtypen / lijnen en dus kunnen worden gebruikt om mestcellen transfecteren evenals alle andere beenmerg-afgeleide cel. Bovendien, in tegenstelling tot virale-gemedieerde transfectie, is elektroporatie niet beperkingen aan de grootte van de getransfecteerde DNA, noch een grondige voorbereiding. In tegenstelling tot de lipide-gemedieerde transfectie, kan electroporatie minder giftig en niet leidt tot endosomale vangen van de getransfecteerde nucleïnezuur.
Bio-Rad ontwikkelde de MXcell elektroporatie systeem speciaal voor deze cellen. de MXcell kunt u voorwaarden verschillen naar uw transfectie-efficiëntie en de levensvatbaarheid van de cellen te maximaliseren. Om de transfectie-efficiëntie te optimaliseren en het minimaliseren van celdood, een veelheid van elektroporatie parameters zoals spanning, kan capaciteit, weerstand en pulslengte worden aangepast en geëvalueerd.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | ||
Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |