Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 2 de 3.
Abstract
Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em fibroblastos de rato embrionárias (MEF), as células de alimentação, como hESCs passagem de placas MEF para alimentação livre de células placas Matrigel.
Protocol
manutenção CTEh cultura diária meios de cultura CTEh deve ser trocada a cada 24 hrs. Do frasco estoque ES mídia armazenada a 4 ° C, retire a quantidade de solução necessária (~ 20ml por 6 bem-prato), coloque em um tubo falcon 50ml, e aquecido a 37 ° C em banho-maria. Uma vez que a mídia está aquecido, adicione bFGF armazenadas a 4 ° C para uma concentração final de 10ng/ml. Coloque o estoque bFGF volta a 4 ° C imediatamente após o uso! Remover das placas de 6-bem todos, mas ~ 500μl …
Discussion
Este vídeo demonstra como hESCs passagem de placas MEF para as placas de alimentação livre de células Matrigel. Note-se que a densidade de colônia em Matrigel é maior do que a densidade de colônias, dividindo usual em MEFs. Imunofluorescência e citometria de fluxo para microscopia ou marcadores CTEh pluripotência, como Oct-4 e SSEA-4, são necessários para confirmar a manutenção de hESCs em um estado indiferenciado em condições de alimentação livre de cultura.
Acknowledgements
Humana estudos de células-tronco embrionárias no laboratório Teitell são suportados por um Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM), as sementes conceder RS1-00313. Agradecemos a membros do Centro de Medicina Regenerativa Broad e Investigação em Células Estaminais na Universidade da Califórnia, especialmente Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, e membros do Instituto Broad Stem UCLA Facility núcleo celular para o seu apoio de nossos estudos.
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